宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV基因分型的研究论文.docVIP

　　宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV基因分型的研究论文 戴淑真，宋克娟，罗兵，姚勤 【摘要】 ［目的］ 研究青岛地区宫颈上皮内瘤变患者的高危型人乳头瘤病毒感染的基因分型情况。［方法］ 应用型特异聚合酶链反应检测宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV的分型情况。［结果］ 各型HPV的感染率之间差异具有非常显著性（χ2=42.632，P 0.001）。四种高危型HPV感染率从高到低依次为：HPV16，HPV58，HPV18，HPV33。［结论］ 青岛地区主要高危型HPV在宫颈上皮内瘤变患者中感染的主要型别依次为HPV16.freelerase chain reaction，PCR)是进行HPV DNA检测及分型最好的方法3。本文研究应用型特异PCR检测青岛地区宫颈上皮内瘤变(CIN)患者主要高危型HPV感染的分型情况。 1 材料与方法 1.1 资 料 1.1.1 资料来源及诊断标准 收集自2004年3月至2006年3月在青岛大学医学院附属医院妇科手术的宫颈癌前病变的患者标本共114例，均为经病理证实的未行放化疗的手术标本，由同一病理医师回顾检查。所有入选的患者均为青岛地区的居民，年龄27~65岁，平均40.4±7.60岁。其中，CINⅠ26 例，CINⅡ 22 例，CINⅢ 66例。所有标本均经常规甲醛固定，石蜡包埋，标本保存时间在1～2年内。每个标本均切取组织3片(每片厚10μm)置入1.5ml EP中，室温保存。 1.1.2 主要试剂 蛋白酶K购自AMRESCO公司，琼脂糖购自BBI分装，DL2000购自Takara公司。MakeⅠ购自天为时代生物有限公司，4种核糖核酸及Taq DNA多聚酶购自大连宝生物工程有限公司。 1.2 方 法 1.2.1 石蜡组织中总DNA的提取 加二甲苯1.5ml于装有组织切片的离心管中，轻微震荡，于37℃水浴放置1h，12 000r/min离心5min，弃上清，重复1次。加入1.0ml无水乙醇，混匀，室温放置10min，弃上清，重复1次。开盖的离心管置于55℃恒温器干燥组织，直到组织完全干燥。用250μl消化液(50mmol/L Tris，pH8.5，200mg/L蛋白酶K)悬浮组织，37℃反应过夜或55℃ 3h，直到组织消化到透亮。然后煮沸10min，灭活蛋白酶K，12 000r/min离心5min，吸上清直接做PCR或分装后放在－20℃保存。用GAPDH引物进行PCR扩增验证DNA提取成功与否。 1.2.2 HPV16.18.33.58.DNA 检测 利用Primer5.0 设计HPV16.18.33.58的特异性的引物进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。 选用25μl扩增体系，内含模板DNA 3μl，10×Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl2 2.5μl，10mM/L dNTPs 0.5μl，10μmol/L的上、下游引物各1.25μl，Taq DNA聚合酶1U，PCR专用水13.8μl。HPV16的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 120s，共40个循环，最后72℃延伸10min。HPV18的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，58℃ 60s，72℃ 120s，共40个循环，最后72℃延伸10min。HPV33的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，56℃ 60s，72℃ 120s，共40 个循环，最后72℃延伸10min。HPV58的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 120s，共35个循环，最后72℃延伸10min。GAPDH的扩增条件：94℃预变性5min，94℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 90s，共35个循环，最后72℃延伸10min。 阳性结果的判断：取PCR 终产物5μl加1μl上样缓冲液点样于2%琼脂糖凝胶中，80V电泳30min以Maker作为参照物。在紫外灯下观测结果并照相，被溴化乙锭染色的DNA在Maker的相应位置上出现的桔红色荧光带即为阳性,否则为阴性。 1.2.3 统计学处理 所有的数据输入计算机，采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，采用χ2检验，P 0.05认为有统计学意义。对多重感染患者，各基因型阳性率重复计算。 2 结 果 2.1 各高危型HPV在CIN患者中的感染情况 宫颈上皮内瘤变的患者114例中，4种高危型HPV的总阳性例数为94例，在宫颈上皮内瘤变的患者中HPV总的感染率为82.46％，见表2。4种高危型HPV的总感染率在CIN Ⅰ，CIN Ⅱ，CIN Ⅲ组分别为53.85％，72.73％，96.97％。三组之间比较χ2值为25.762，P 0.001，CIN