拟南芥VSP蛋白的表达和生化活性的研究.pdfVIP

摘要 拟南芥VSP 蛋白的表达和生化活性的研究 摘 要 植物的营养储存蛋白 （vegetative storage proteins, VSP ）被认为是一种存在 于植物营养组织中的氨基酸或氮源的临时储存形式，它们表达量丰富，在植株 其他部位需要营养时 （如种子形成时）被降解，以满足植物生长发育的需要， 大豆（soybean ）中的VSPα 和VSPβ 是这类蛋白中发现最早和研究最多的。VSP1 和VSP2 是在拟南芥（Arab idopsis thaliana ）中发现的大豆VSP 的同源蛋白，虽 然还没有它们作为临时营养储存功能的报道，但它们与大豆VSP 蛋白的氨基酸 序列同一性达到40 ％，并且具有相同的表达调控模式，也能与大豆VSP 的抗体 相互作用。根据氨基酸序列的对比分析，拟南芥的VSP1 和VSP2 属于HAD 家 族（the haloacid dehalogenase superfamily ）中的酸性磷酸酶，具有特征序列 DXDXT 。同时，VSP1 和VSP2 也是一种植物防御蛋白，参与了茉莉素诱导的植 物防御的信号途径，在植物对抗植食性昆虫和病原菌的侵害中发挥重要作用。 有文献报导重组表达的VSP2 具有抗虫活性，而且这种抗虫活性与其酸性磷酸酶 的活性相关。因此利用分子生物学等手段克隆出拟南芥VSP 蛋白的基因，实现 拟南芥VSP 蛋白的高效异源活性表达，进行蛋白晶体结构与催化机制的研究， 是进一步了解VSP 蛋白在植物防御中如何发挥作用的重要基础。 本研究利用分子生物学手段从拟南芥cDNA 文库中扩增得到拟南芥VSP 蛋 白的编码序列，并将获得的VSP 基因构建到原核表达载体pET22b 上并在大肠 杆菌BL21 菌株中得到高效可溶性表达。将得到的重组VSP 蛋白进行Ni-NTA 亲 和层析分离纯化，可获得电泳纯的重组VSP 蛋白。从1L 大肠杆菌LB 培养液中 经过离心破碎，亲和层析后能得到约12mg 左右的纯蛋白。将得到的电泳纯的蛋 白除盐透析后，以pNPP 为底物检测，发现两种重组VSP 蛋白都具有酸性磷酸 酶活性。规定一个酶活单位为37℃在 1min 内能转化1μmol 底物的酶量。VSP1 和VSP2 的比酶活为7.21 U/mg 和8.15U/mg 。VSP1 和VSP2 的最适pH 为4.5 ， I 拟南芥VSP 的表达和生化活性的研究 最适温度为37℃，酸性磷酸酶活性受Cu2+影响最大。重组蛋白表达量高，纯化 后均一性好，适于蛋白晶体生长。 关键词 拟南芥VSP ；克隆表达；pNPP ；酸性磷酸酶活性 II Abstract The bacterial expression and biochemical activity of VSP from Arabidopsis thaliana Abstract Vegetative storage proteins (VSP) are proteinaceous storage reserves that have been identified from numerous plants. They act as temporary storage of amino acids that can buffer the availability of nitrogen and other nutrients, as well as biosynthesis and degradation of VSPs are thought to be regulated by temporary storage needs. The best-characterized VSPs are soybean VSPα and VSPβ. VSP1 and VSP2 fro