PGA基因在酿酒酵母中表达研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１１）：３２～３５ ＰＧＡ基因在酿酒酵母中的表达研究 １ １，２ ２ 陈文颖 　赵　敏 　魏德强 （１东北林业大学生命科学学院　哈尔滨　１５００４０　２东北林业大学大庆生物技术研究院　大庆　１６３３１６） 摘要　根据ＧｅｎＢａｎｋ中巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）的ＰＧＡ基因序列设计了上下游引物， 通过ＰＣＲ扩增出巨大芽孢杆菌１．１７４１中的ＰＧＡ基因。将该基因连接到Ｔ７ｌａｃ启动子控制下的 ＋ ＋ 表达载体ｐＹＥＳ２（ａｍｐｕｒａ）上，构建了重组质粒ｐＹＥＳ２ＰＧＡ。用ＬｉＡｃ／ＳＳＤＮＡ／ＰＥＧ方法将其转 化进酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ１５８中表达，在不需要苯乙酸诱导的重组菌株发酵液中 检测到了青霉素酰化酶活性，最高酶活达到０．７５Ｕ／ｍｌ。将该ＰＧＡ基因测序结果与 ＧｅｎＢａｎｋ中 巨大芽孢杆菌Ｌ０４４７１．１、Ｕ０７６８２．１和Ｚ３７５４２三株的ＰＧＡ基因序列比对，表现出很高的同源性， 分别达到９７．１％、９９．８％和９９．８％。 关键词　巨大芽孢杆菌　青霉素酰化酶　酿酒酵母　表达 中图分类号　Ｑ７８６ 　　青霉素 Ｇ酰化酶（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧａｃｙｌａｓｅ，ＰＧＡ）是生 业上应用于表达重要的蛋白质方面显示了极大价值。 产半合成 内酰胺类抗生素的重要工业用酶。它能够 本文介绍酿酒酵母表达巨大芽孢杆菌青霉素Ｇ酰化酶 β 水解青霉素 Ｇ生成苯乙酸（ＰＡＡ）和６氨基青霉烷酸 的研究结果。 ［１］ （６ＡＰＡ） ，同时它也可以催化一些青霉素和头孢霉 ［２］ １　材料与方法 素的合成 。青霉素 Ｇ酰化酶常由微生物生产，大肠 杆菌是产生胞内青霉素Ｇ酰化酶的典型微生物，但是 １．１　材　料 提取 纯 化 过 程 复 杂；巨 大 芽 孢 杆 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ １．１．１　菌株和质粒　巨大芽孢杆菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）是产生胞外青霉素 Ｇ酰化酶的典型微生 １．１７４１，中国普通微生物菌种保藏管理中心提供；大肠 杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５，本实验室保存。酿酒酵母菌株 物，但是它需要苯乙酸诱导表达，而且发酵过程中需要 α     变温诱导，给生产带来了不便。 （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｈ１５８（ｈｉｓｔｒｐｌｅｕｕｒａ）及酿酒酵母／大 　　国内外关于ＰＧＡ的基因工程研究多基于大肠杆 ＋ ＋ 肠杆菌穿梭质粒ｐＹＥＳ２（ａｍｐ ｕｒａ）为哈尔滨工业大 菌，关于巨大芽孢杆菌ＰＧＡ基因遗传分析的报道还不 学宋金柱老师馈赠。 ［３］ ［４］ 多。张兰芳等 和Ｍａｒｔｉｎ等 分别克隆到巨大芽孢杆 １．１．２　主要试剂　各种限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合 ［５，６］ 菌ＰＧＡ基因，在大肠杆菌中作了表达；Ｋａｎｇ等 和黄 酶、ＤｅｎａｔｕｒｅｄＳｈｅａｒｅｄＳａｌｍｏｎＳｐｅｒｍ ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、 ［７，８］ ｄＮＴＰ购自ＴａＫａＲａ公司；溶菌酶、ＲＮａｓｅＡ、ＤＮＡ琼脂糖 艳红等 还在大肠杆菌及枯草杆菌中作了表达。而