一株重组大肠杆菌pET-28a-lpgad的构建及其高效.PDFVIP

田灵芝 等/一株重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad 的构建及其高效生产γ-氨基丁酸转化条件的优化 65 生 物 工 程 学 报 Chinese Journal of Biotechnology January 25, 2012, 28(1): 65−75 /cjbcn ©2012 Chin J Biotech, All rights reserved 工业生物技术 /pET-28a-lpgad γ- 田灵芝，徐美娟，饶志明 江南大学工业生物技术教育部重点实验室 江南大学应用微生物与代谢工程研究室，江苏 无锡 214122 田灵芝, 徐美娟, 饶志明. 一株重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad 的构建及其高效生产γ-氨基丁酸转化条件的优化. 生物工 程学报, 2012, 28(1): 65−75. Tian LZ, Xu MJ, Rao ZM. Construction of a recombinant Escherichia coli BL21/ pET-28a-lpgad and the optimization of transformation conditions for the efficient production of γ-aminobutyric acid. Chin J Biotech, 2012, 28(1): 65−75. 摘 要: 为实现微生物法高效率生产 γ-氨基丁酸 (GABA) ，从一株经多次诱变筛选的具有较高谷氨酸脱羧酶 (GAD) 活力植物乳杆菌 GB 01-21 全基因组 DNA 中 PCR 扩增获得 GAD 酶基因 lpgad ，构建重组质粒 pET-28a-lpgad ，在大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) 中高效诱导表达。并采用Ni 柱亲和层析纯化获得重组 GAD ， 并对其酶学性质进行初步研究，为改良转化工艺提高 GABA 产量提供可靠理论依据。结果显示，重组大肠杆 菌中 GAD 酶活显著提高，可达 8.53 U/mg ，是植物乳杆菌 GB 01-21 中 GAD 酶活的 4.24 倍。将该重组菌应用 于转化 L-谷氨酸生产 GABA ，5 L 发酵罐水平转化 24 h 产量可达 143.5 g/L，摩尔转化率为 97.32 ％，是植物乳 2+ 杆菌 GB 01-21 的 2.19 倍。纯化后酶学性质进行初步研究表明：其最适 pH 为 4.8 ；最适温度为 37 ℃；Ca 、 Mg2+对其有较强的激活作用，将上述实验结果用于转化条件的优化，最终 5 L 发酵罐上进行转化实验，批次添 加底物 L-谷氨酸共 600 g ，转化 24 h ，GABA 累计浓度可达204.5 g/L ，摩尔转化率为 97.92 ％，与最初转化条 件相比，GABA 浓度提高了 42.5 ％，为其工业化应用打下了良好的基础。 关键词: γ-氨基丁酸，谷氨酸脱羧酶，重组大肠杆菌，全细胞转化，优化 Received: June 24, 2011; Accepted: August 29, 2011 Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB725202), Program for New Century Excellent Talents in University (No. NCET-10-0459), National