第四次实验 脂类化学—苏丹III染色法.docVIP

脂类化学—苏丹Ⅲ染色法 2011年3月31日 【实验目的】 了解脂肪染色的原理、操作步骤及脂类标本制片原理。 【实验材料】 1.试剂：苏丹染液：将0.15克苏丹溶解于100ml70%酒精或纯丙酮和70%酒精混合液中，临用时过滤，所得滤液即为饱和浓度。2.器具：显微镜，载玻片，盖玻片。 脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。如果组织中脂肪过多，将会影响其正常功能。如脂肪肝。 脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。 脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类，而使脂类显色的原理显示脂类，使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。 苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。 脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂，丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂，这样可以染色大的脂肪积累块，但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂，可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质，但是能溶解染料，是比较理想的溶剂。用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀，防止蒸发，因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。 图 1 脂肪染色（10×10） 图 2 脂肪染色（10×40） 图 3 脂肪染色局部放大图 【分析与讨论】 ㈠结果分析 由以上三幅图可看出，染色较为成功，可以观察到脂肪细胞呈圆球形，内充满橘色脂类物质，并可以观察到小鼠肠系膜上脂肪细胞附着的血管。 但从图中也可看出，脂肪细胞多层叠在一起，且染色并不充分，细胞没有呈现出明显的桔红色，而是一种呈一种偏淡黄的颜色。造成这种现象可能的原因为：铺片时，没有将肠系膜铺的足够充分，导致脂肪细胞重叠，影响观察，进而影响了染色，因为细胞层数多，染液很难进入到细胞中，30min后，细胞依然没有呈现出桔红色。 在铺片时应掌握好力度，若用力过大，则肠系膜容易被撕破，铺片不成功；若用力过小，则细胞不能被铺呈单层，影响染色及观察。 ㈡实验中注意事项有： 1.在抓握小鼠时，应迅速掐住其两耳之间的皮肤，使其头部不可扭动，并用同一只手掐住其背部至尾巴的皮肤，使小鼠整个腹部皮肤紧绷，不能反击。 2.铺片时尽量使细胞铺成单层，且要使小肠包围盖玻片大半部分，以防止肠系膜收缩，使细胞叠成多层。 3.找肠系膜时应尽量小心，以免将肠系膜扯破，且要找有血管的肠系膜，因为血管周围一般有脂肪组织保护，制作装片时应尽量用盖玻片铺开肠系膜。 ⒋染料溶液脂类而使其着色，使用时应注意选择溶剂，要求既要溶解染料，又不溶解脂肪。 脂肪细胞 血管 脂肪细胞 血管