地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探　论文.docVIP

　　地龙脱氧核糖核酸酶的部分性质研究及作用初探　论文 .freelical characterization and effect of lumbricus dornases (LDs). Methods Sephacryl-200 column chromatography, CIEF and agarose electrophoresis ine LDs. Results The molecular id and λDNA. Conclusion LDs is a neination of molecular id and λDNA degradation imply that LDs can oppose bacteria drug resistance. Key bricus；dornases；molecular acia；Coomassie Brilliant Blue G250, Fluka；毛细管等电聚焦试剂盒(cIEF3-10 Kit)；质粒(pBV220),由本实验室自备；λDNA,Sigma公司产品。其它所用试剂均为分析纯。 1.2 主要仪器 Gradifrac V1.2层析系统,pharamacia公司；毛细管电泳仪：BECKMAN 55002。 2 实验方法 2.1 分子量测定 凝胶过滤层析(分子筛)法：参照文献4方法。 2.2 等电点测定 毛细管等电聚焦电泳法：参照文献5方法。 2.3 LDs对质粒的降解作用 取3 μL质粒(pBV220),分别加入LD1、LD2 10 μL,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。 2.4 LDs对λDNA的降解作用 取2 μLλDNA,分别加入LD1、LD2 10 μL,37 ℃反应30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。 3 结果 3.1 凝胶过滤层析(分子筛)测定LDs分子量 以标准蛋白质洗脱体积为纵坐标,标准蛋白质分子量的对数为横坐标,绘制标准曲线。根据LD1、LD2的洗脱体积,查标准曲线,并计算出用Sephacryl S-200测得LD1、LD2分子量分别为126、62 kDa。 3.2 LDs等电点的测定结果 毛细管等电聚焦法测定等电点的结果：LD1、LD2等电点分别为6.12、6.05。 3.3 LDs对质粒(pBV220)的降解作用(见图1) LD1、LD2与质粒作用30 min后电泳,EB染色观察,LD1、LD2彻底降解了质粒。倍比稀释的LD1、LD2分解质粒的作用减弱,可以看到仍有微弱的质粒条带出现。LDs对质粒有明显的降解作用,从图1中看不出LD1、LD2对质粒的降解作用有明显的差别。 3.4 LDs对λDNA的降解作用(见图2) LDs与λDNA作用30 min后进行0.8% 琼脂糖凝胶电泳,EB染色后分析结果。LD1、LD2 作用后的λDNA条带减弱,图2的下方有云雾状的阴影,为λDNA的降解产物。说明LD1、LD2有降解λDNA的作用。图2中看不出LD1、LD2对λDNA降解作用有明显的差别。 4 讨论 脱氧核糖核酸酶(DNase)已在不同的物种中发现,目前针对其研究较多的是DNaseⅠ、DNaseⅡ。DNaseⅠ是Sachs61905年首次在牛胰腺中发现,现对DNaseⅠ的研究已扩展到人、鸡、鼠、犬及鲤鱼等动物。已纯化出不同来源的DNaseⅠ的分子量在32～41 kDa范围之间,等电点在3.9～4.7之间。DNaseⅡ存在于各种哺乳动物的组织中7,尽管来自各种不同种属和组织的DNaseⅡ的化学性质并不完全一样(如分子量、亚基结构),但这些酶的酶学性质非常相似。迄今已纯化出不同来源的DNaseⅡ的分子量范围在26.5～45 kDa之间。我们发现的LD1、LD2分子量为126、62 kDa；等电点为6.12、6.05。LDs与DNaseⅠ、DNaseⅡ分子量有很大差别,分子量远远大于DNaseⅠ、DNaseⅡ；LDs的等电点也明显不同于DNaseⅠ。可以推测,LDs是新型的脱氧核糖核酸酶,具有不同的性质。 质粒是细菌染色体以外能自主复制的,双链共价闭合环状DNA。细菌对药物产生抗性,原因多种。现在研究的热点是耐药性质粒(其携带耐药基因),质粒可以从一个细菌进入另一个细菌,耐药基因也从一个细菌传到另一个细菌,致细菌耐药性的广泛产生。噬菌体是感染细菌的一类病毒,有的噬菌体基因组较大,如λ噬菌体和T噬菌体。λ噬菌体由外壳蛋白和λDNA(线状双链DNA分子)组成。通过溶原性方式λDNA能整合到细菌染色体DNA中,与λDNA相毗邻的细菌基因有可能被噬菌体从一个细胞转移到另一个细胞(即转导),使遗传性状在