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荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）蛋白质或其他分子在活细胞内互相结合的时间和地点是了解它们的功能的关键问题。要回答这一问题，将蛋白质标上不同的荧光团。但是，光学显微镜的光学分辨率将蛋白质探测精度限制到大约0.2μm左右。要研究蛋白质成分的相互物理作用，需要较高的分辨率。1.什么是FRET？FRET就是采用非放射性方法，在供体和受体相互靠得很近（1-10 nm）时，将光子能从一个受激励的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体）。 采用FRET，可以解决超过光学显微镜光学显微限度的分子相对邻近度问题，来显示（例如）（1）二个蛋白质成分间分子相互作用；（2）一个分子内部（如酶活动能力、DNA/RNA形态）的结构变化；（3）采用象CFP-YFP Cameleon这样特别的FRET-工具的离子浓度。2.FRET原理受激励后的荧光团（供体）将受激励的静能转移到一个光吸收分子（受体）。这种能的转移是非放射性的，其主要原因是供体和受体之间的偶极-偶极间的相互作用（图示见附件）只有几个荧光团对才适合FRET实验，因为，除了其他必要条件（如偶极子定向、足够的荧光寿命），供体放射光谱必须将受体的激励光谱重叠起来。已知的FRET对是CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/诺丹明、FITC/Cy3象绿色荧光蛋白质（GFP）这样的荧光蛋白质（FPs）对FRET实验非常有吸引力。它们可以以基因方法被融合到有关蛋白质中去并且用细胞表达，使它们成为基因表达和蛋白质在活细胞中本地化的极好报告系统。可以提供不同光谱特性的增强型FP变异。用青绿色的CFP作供体、黄色的YFP（都是通过GFP点突变而来）作受体是最适合做活细胞FRET实验的，因为CFP放射光谱部分重叠了YFP激励光谱。3.主要的实验流程（具体的实验流程请见附件）这里以使用最多的YFP-CFP对为例a、构建两个带验证的蛋白的荧光蛋白标记载体（pEYFP-c-A，pECFP-n-B,这里选择荧光蛋白的C型和N型载体的原因后面会提到）b、共转染细胞；c、在检测窗口，在荧光显微镜下观察结果，在CFP的激发光区测定CFP和YFP的发射光的强度比，进而判断A和B结合的强弱。二、生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）1、BRET原理（图示见附件）：这个技术同样是建立在能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白的突变体GFP）之间会发生能量转移。例如，在一些海洋生物（如水母Aequorea victoria和海参R. reniformis）中自然发生一种能量转移现象――生物发光共振能量转移。在这个过程中，Renilla的荧光素酶（Rluc）在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光（480nm），能够转移能量到GFP的突变体上[增强的黄色荧光蛋白(EYFP)], 随之后者发出530nm的绿光。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近（100 A°）的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。因为BRET信号是一个比率数，不是一个绝对量，它消除了那些因为由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。2、主要实验流程基本同FRET，只是检测手段不同，请见附件。三、双色荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementation，BiFc）双分子荧光互补 (bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 分析技术，是由 Hu 等在 2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术. 该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用. 其后发展出的多色荧光互补技术 (multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较. 目前，该技术已用于转录因子，G 蛋白 β γ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上.1、BiFc原理（图示见附件GFP家族（GFP，CFP，YFP，BFP）有一重要性质——循环排列，(circular permutation)。GFP、YFP、CFP和 BFP都是由 238 个氨基酸组成的单体蛋白质, 荧光的产生主要归功于分子内第 65、66