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蛙的骨骼形态观察及标本制作新思路 刘亮 (井冈山大学生命科学学院 08生物本（1）班 摘 要：两栖纲动物的骨骼在生物进化过程中具有保护，支持作用。在动物进化过程中，两栖纲动物已经具备了登陆的身体结构。在水栖过渡到陆生的进化中，两栖纲的骨骼发生了巨大变化，获得了比鱼类更大的坚韧性，活动性和对身体及四肢的支持作用。本研究通过观察青蛙骨骼及对其骨骼标本的制作，并在此基础上完善并探索标本制作的新方法，从而为动物骨骼的研究开创出新思路。 关键词：骨骼 标本 制作 新方法 新思路 1．材料与方法： 1.1 取材：蟾蜍( 癞蛤蟆或疥蛤蟆)的幼蛙和成蛙。 1.1.1 标本处理： 方法1:将选择好的蟾蜍进行剥皮, 在剥皮处理过程中, 要特别注意避免损坏四肢的趾, 以保证蛙的完整性。再经腹前正中切口去内脏, 要求去净且不损伤骨骼及胸、盆壁为宜, 然后将标本用清水冲洗干净。 方法2: 将选择好的蟾蜍不行剥皮处理, 仅经腹前正中切口去内脏,要求及冲洗同前。 方法3: 将选择好的蟾蜍装于笼、池中置放2～3 d, 让蛙的消化道内容物充分消化、排除, 然后将蛙冲冼干净。 方法4: 用乙醚将青蛙麻醉致死。剥去青蛙的全身皮肤。剖开腹壁，除去内脏。此时宜小心不要损坏胸骨和肋骨。先把脊椎背面及腹部的肌肉粗略除去后，用水浸泡两天，可放置锅内煮熟或成半熟，但不可煮得过度。把附有残肉的骨骼放在6％－10％的氢氧化钠溶液中浸2－6小时（视肌肉变透明，用牙刷能除去为止），使肌肉腐败，并能溶去脂肪及措出。一但是对于附有韧带的骨骼，浸渍不宜过度，否则会导致韧带腐败。所以在浸渍时，应时观察。浸渍后用水清洗，洗去氢氧化钠，最后清除脑及脊髓。1.1.2 标本的固定： 将处理好的标本凉干后, 采用体积分数95%酒精或5%～10%福尔马林液( 透明不如前者理想) 进行固定3～5 d, 使标本有良好的形态, 利于观察研究。 1.2 药液的配制： A 液: KOH 0.5～1.0 g, 蒸馏水100 ml。 B 液: 茜素红0.01～0.02 g, KOH 1.0 g, 蒸馏水100 ml。 C 液: 丙三醇20 ml, KOH 1.0 g, 蒸馏水80 ml。 D 液: 梯度丙三醇, 分别为丙三醇50 ml, 蒸馏水50 ml;丙三醇75 ml, 蒸馏水25 ml。 1.3 方法 1.3.1 脱水由低浓度逐渐向高浓度的乙醇进行。每次3～5 d,换液1 次。乙醇浓度梯度为含体积分数80%、90%、100%。 1.3.2 脱脂在丙酮内脱去脂肪, 时间为5～7 d, 中间换液1 次。 1.3.3 再脱水将脱脂标本用体积分数95% 酒精洗净丙酮,再放置含体积分数100% ( 无水) 酒精内脱水, 时间为5～7 d,中间换液1 次。 1.3.4 入A 液中处理 将再次脱水后的标本缚在玻璃片上固定, 放入A 液中浸泡。标本材料用低浓度碱性溶液浸泡使组织软化膨胀可提高甘油的渗透力, 增强透明度。时间可根据标本的大小、剥皮与否而定, 以能观察到肌肉呈半透明状态, 隐约能看到骨骼为宜( 时间1～2 d) 。 1.3.5 入B 液中处理 将标本从A 液中取出放置B 液中浸泡,使色素着色于骨骼。在染色过程中要根据标本大小、剥皮与否而定, 同时要随时观察, 以可见到骨组织染成紫红色为止( 时间1～3 d) 。 1.3.6 入C 液中处理 将标本从B 液中取出放置C 液中浸泡,使软组织所着染的色素逐渐脱色变成白色, 直到能看到骨组织呈紫红色为止( 时间3～7 d) 。 1.3.7 入D 液中处理 将标本从C 液中取出放置D 液中浸泡,分别经梯度丙三醇液中继续脱色, 使软组织逐渐变为无色, 直到没有多余的颜色出现, 骨组织清晰可见为止, 时间为2 个月左右。然后, 装瓶浸泡于纯丙三醇液中, 长期保存及应用。 2．结果和分析 除标本材料要求新鲜和充分冼涤去血的前提外, 制作透明标本的关键是脱水、脱脂。只有脱水、脱脂充分才能使组织达到更彻底的透明。标本放置在KOH 溶液中的时间和KOH 溶液的浓度, 要视材料的大小和它的透明程度来决定。软组织仅经含体积分数1% KOH 溶液浸泡后迅速软化膨胀, 逐渐变成半透明的胶冻样结构, 使软组织的坚实性大为降低。因此在时间上和浓度上注意控制: 时间过长会使骨骼松散, 时间过短则骨骼不易着色,浓度过高会损毁组织, 使标本出现骨骼脱落的现象, 浓度过低则达不到效果。故在制作过程中, 须注意轻柔操作, 以免损坏标本。染色液的浓度和染色的时间, 要根据材料的大小和剥皮与否而定。在染色过程中要随时注意观察, 当骨骼染成紫红色即可, 不宜过深, 否则影响软组织脱色, 使透明的效果不佳