百合斑驳病毒CP与CI基因的融合表达、多抗制备及其应用.pdfVIP

植物病理学报 ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA 40(5)：475-481(2010) 百合斑驳病毒 CP与 C／基 因的融合 表达 、多抗制备及其应用 童勋章 ， ，王亚军 一，谢忠奎 ，张玉宝 ，安丽萍 ，郭志鸿 ，郭 芳 (巾科院寒i旱区环境与T程研究所皋兰生态与农、综合试验站，兰州 730000； 中科院寒区旱区环境与T程研究所极端环境生物抗逆特性 j生物技术实验室，兰州 730000) 摘要 ：采用 RT—PCR 法从甘肃地 区引种的切仡 百合上克隆了百合斑驳病毒 (Lilymottlevirus，LMoV)的外壳蛋闩(coat protein，CP)基因与细胞质 内含体 (cytoplasmicinclusions，C1)基 的3端 600bp片段，连接到原核表达载体 pET一28a(+) f，构建了融合表达的重组质粒pET一28a—CP—CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋r1CP—CI200。经镍柱 亲和层析获得纯化的融合蛋广1，进一步用其免疫家兔制备了多克降抗体。WesternBlot结果显示 ，该多抗与感染LMoV的 百合叶片中的病毒CP与 cI均发牛特异性反应 ，而对健康百合叶片尤反应。用该多抗建立双抗央心酶联免疫吸附法 (DAS—ELISA)检测百合叶片样品，相对于RT—PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93．3％。研究结果为快速 、准确检测百 合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。 关键词 ：百合斑驳病毒；外壳蛋 白；细胞质 内含体 ；抗体；DAS—ELISA；病毒检测 Production and application ofantisera to expression productofCP and Clfusion geneofLilymottle virus TONGXun—zhang一，WANGYa-jun一，XIEZhong—kui’一，ZHANG Yu—bao ，，AN Li．ping，，GUO Zhi—hong，GUO Fang’， (GaolanEcologicalandAgriculturalIntegratedEx— perimentStation，Cold and Arid RegionsEnvironmentaland Engineering Research Institute，ChineseAcademy ofSciences， Lnazhou730000，China；。LaboratoryofPlantStressEcophysiologyandBiotechnology Cold andAridRegionsEnvironmental ， andEngineeringReserachInstitute，ChineseAcademyofSciences，Lanzhou730000，China) Abstract：ThecDNA rfagmentsofCP geneandthe3 terminalofC／geneofLilymottlevirus(LMoV) wereamplifiedbyRT—PCR rfom importedcutflowerliliesin Gansu Province．TheamplifiedPCR rfagments weretheninsertedintothevectorpET一28a(+)，andtherecombinantplasmidpET一28a—CP—CI200wascon— structed．AftertransformationoftherecombinantpET一28a—CP—CI200toE．coliBL2Istrain，thefusionprotein wasinduced expressed．Thepurified protein wasobtained by Ni“ affinity chromatography．Afterrenatu— ration，theproteinwasusedtoraisepolyclonalantibodiesinrabbit．W esternblotanalysisshowedthattheanti— serawerespecificallyreactedtoviralCP andCI