臭矢菜丛枝病植原体的分子鉴定研究.pdfVIP

植物病理学报 ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA 39(4)：377-384(2009) 臭矢菜丛枝病植原体 的分子鉴定研究 李 永，田国忠，徐启聪，朴春根 ，汪来发，郭民伟 (中国林业科学院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室，北京 100091) 摘要：本实验采用 DAPI荧光显微镜、PCR、克隆和测序等技术，对海南臭矢菜丛枝病样进行了检测和鉴定。以染病臭矢菜 总DNA为模板应用 3对植原体特异性引物进行 PCR扩增，获得PCR产物为 16SrDNA(1430bp)、16S-23SrDNA(358 bp)、rpDNA(1294bp)。应用DNA回收试剂盒获得了3个PCR扩增片断的纯化产物，并克隆到DH5ct大肠杆菌中测序。 应用DNAMAN和MEGA软件对获得的序列与NCBI数据库中植原体序列进行同源性分析和构建系统发育树。结果显示 臭矢菜丛枝病植原体与花生丛枝病植原体序列同源性最高，16SrDNA的序列同源性为99．9％，16S-23SrDNA高达 100％， 为99．7％，因而将臭矢菜丛枝病植原体归为花生丛枝组 (16SrⅡ)，根据 16SrDNA的RFLP分析，将其归为 16SrII—A 亚组 。 关键词：臭矢菜丛枝病；植原体；分子鉴定 ；序列测定 Molecularidentificationofcleomew itches-broom phytoplasma LIYong，TIAN Guo． zhong，XUQi-cong，PIAOChun—gen，WANGLai—fa，GuoMin—wei (ResearchInstituteofForestEcology，Envi— ronmentandProtection，TheKeyLaboratoryofStateForestryAdministrationonForestProtection，ChineseAcademyofForestry， Beijing100091，China) Abstract：Cleomewitches-broomphytoplasma(CWB)collectedfromHainanProvince，wasdetectedandi— dentifiedusingDAPIfluorescencemicroscopy，PCR，clonena dsequencingtechniques．ThreedifferenttypeU— niversalprimerpairsofphytoplasmawereusedtoamplify1．43kbfragmentof16SrDNA ，0．36kbfragment of16S-23S rDNA and 1．3 kb fragmentofrp DNA．Then PCR—ma plified productswere cloned and se— quenced．Th eresultsofsequencingnadhomologuouscomparisonwithohterphytoplasmasshowedhtatcleome witches-broom phytoplasmashared99．9 ％ similaritywiht pena utwitches-broom phytoplasmain16SrRNA gene．100％ in 16S-23SrRNA geneand99．7％ in rp gene．Cleomewitches-broom phytoplasmami ghtbe sortedintopenautwitches-broom group(16SrⅡ)，16SrII—AaccordingtohteresultsofRFLPnadsequen— cingof16SrDNA． Keywords：cleomewitches-broom disease；phytoplasma；moleculra identification；sequencing 中图分类号：$432．4 文献标识码：A 文章编号：0412-0914(2009)04-0377-08 植 原 体 (phytoplasma)，原 称 类 菌 原体 20世纪90年代 以来，特别是PCR及分子克隆 (MLO)，为无细胞壁原核微生物 ，尚不能在人工培 等分子技术应用于植原体的研究以后，植原体检 养基上离体培养，在植物和 昆虫中广泛分布。