一种豇豆重花叶病毒RT-PCR检测方法的研究.pdfVIP

2010年第4期 植物检疫 PLANTQUARANTINE 一 种豇豆重花叶病毒 RT—PCR检测方法的研究 李 彬 吴翠萍 粟 寒 安榆林 (江苏出入境检验检疫局 江苏南京 210001) Research onamethodofRT — PCR fordetection ofCowpea severemosaicvirus．LiBin。Wu Cuiping．Su Han，AnYulin(JiangsuEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Nanjing210001，China) Abstract Amethodofreversetranscript(RT)PCRwasresearchedfordetectionofCowpeaseveremosaicvirus (CPSMV)．ByusingstandardCPSMVstrainsintroducedfromATCCandDSMZasmaterials，RT—PCRmethod whichshowedgoodamplificationreactionandspecificitywasconstitutedanditssensitivitycouldreach1Pgtotal RNAofleaftissueinfectedbyCPSMV．Meanwhile，thesensitivityofdoubleantibodysandwichELISA (DAS— ELISA)ofrtestofCPSMVwasonly101xgleaftissue．TheRT—PCRmethodwassuitableofrrapiddetectionof CPSMV rfom legumeseedsandseedlingssuchascowpea． Keywords CPSMV；degenerateprimer；RT — PCR；DAS—ELISA 摘要 对一种豇豆重花叶病毒(Cowpeaseveremosaicvirus，CPSMV)反转录PCR分子检测方法进行了研 究。利用从美国菌种保藏中心和德国微生物毒株保藏中心引进的CPSMV标准毒株，设计了一对特异性简 并引物(CPSMVf／CPSMVr)，建立 了CPSMVRT—PCR检测方法。该方法具有 良好的扩增反应及特异性， 灵敏度可达 1pg的总病叶组织RNA量。CPSMV双抗夹心酶联免疫法(DAS—ELISA)灵敏度为 10g叶组 织。该方法适用于豇豆等豆类蔬菜种子及种苗 中对豇豆重花叶病毒的快速检测。 关键词 豇豆重花叶病毒；简并引物；反转录PCR；双抗夹心酶联免疫法 中图分类号 S41—31，$643．4 豇豆重花叶病毒 (Cowpeasveeremosaicvirus， 此，CPSMV传人、定殖和扩散 的可能性都很大，并 CPSMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)豇豆花 可随种子的调运和害虫在国内传播。CPSMV已成 叶病毒属(Comovirus)的确定种…。该病毒的自然 为我国豆科植物尤其是豇豆和大豆生产潜在 的巨 寄主为豆科植物，可严重侵染豇豆、大豆等多种作 大威胁 。我 国已将该病毒列入 《中华人民共和国进 物。该病毒侵染豇豆后，可造成叶片花叶和斑驳， 境植物检疫性有害生物名录》。 严重的可导致整株枯死；在 田间对豇豆的侵染率可 目前，国内外还没有豇豆重花叶病毒分子检测 达 300％，造成产量损失可达 50％ “。 方法的报道，也没有豇豆重花叶病毒 RT—PCR检 目前CPSMV主要分布在美洲地区，如美国、巴 测方法的报道。本文利用 CPSMV标准毒株，设计 西、秘鲁、委内瑞拉、特立尼达、波多黎各、哥斯达黎 了一对简并引物，开展了CPSMVRT—PCR检测技 加和苏里南等 国家 J，中国尚无发生与危害的 术的研究和探索。 报道 。 1 材料与方法 CPSMV可通过种子进行远距离传播，其 中豇 1．1 材料 豆的种传率为 10％，长豇豆 (Vignasesquip