油菜基因转化.pdfVIP

山西大学学报(自然科学版)28(2):192~195.2005 Journal of Shanxi UniversityO、Jat. Sci. Ed. ) 文章编号:0253-2395(2005)02-0192-04 农忏菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究 周小梅李君剑1 ，赵军良2 ，梁爱华2 龄 0. 山西大学生命科学与技术学院，山西太原 030006; 2. 山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原 030006) 摘 要:用农杆菌介导法对芥菜型油菜进行了转化，并对影响根癌农杆菌转化效率的因素进行了研究，建立了以油 菜子叶柄为外植体的转化体系.用携带喝毒素(BmKITs)和几丁质酶(chi)双价基因的农杆菌转化油菜，共获得了抗 卡那霉素的再生苗 153 株，移栽成活 21 株.对成活植株进行了 PCR 分子检测，证实有外源基因的整合.转基因植株 形态正常，开花、结实. 关键词:芥莱型油菜;根癌农杆菌:子叶柄;转化 中固分类号:Q943 文献标i只码 :A 随着基因工程技术的发展，利用植物基因工程的方法获得转基因抗虫植物日益增多.目前主要用的抗虫 基因是 Bt 基因[IJ 和植物来源的蛋白酶抑制剂基因，它们都有一定的杀虫效果，但随着转抗虫基因植物在大 田中的应用，昆虫的抗性问题随之产生，解决问题的方法之一是联合使用两种或两种以上的具有不同杀虫机 制的抗虫基因，使昆虫产生抗性的几率大大地降低.由于目前转化油菜主要集中在甘蓝型油菜[Z~5] ，芥莱型 油菜的转化很少，因此我们将实验室克隆井构建的双价抗虫基因，用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 法 转化芥菜型油菜，建立起芥莱型油菜(Brassica juncea) 的转化体系，同时获得具有抗虫性的油菜转化体，为 以后进一步的转基因研究提供依据. 1 材料和方法 1. 1 植物材料 供试的品种是芥菜型油菜 33B 和 918B. 选取饱满的油菜种子，用体积分数为 70 %乙醇浸泡3 min ，质量 浓度(下同)为 0.1 %HgCI 溶液表面灭菌 5 min ，无菌水冲洗 4~5 次 Kam 5a1 1 sam 1 Hind m Hind m 2 后，播种于 MS[6J 固体培养基上，在 25 C 下，光强 4000 Ix~10000 lx 和 每天光照 16 h 条件下培养成苗，取 5 d 苗龄的子叶柄作为农杆菌的转 18(1) BmK355355 chi 355 (R) 化材料. 1. 2 菌种和质粒 图 1 pb n01 携带基因 BmKI Ts-chi 融合基因 所用农杆菌EHA105 其中含植物表达载体质粒 pBIl 01 ，该质粒含 有昆虫特异性的蝠毒素基因(BmKITs)和几丁质酶基因(chi)(如图1). 1. 3 根癌农杆菌转化和植株再生 将农忏菌单菌落接种于含有 Km 50 mg/L、 Str 125 mg/L 的液体 YEP 培养基中，振荡培养(28 C , 收稿日期:2004-06-21 ;修回日期 :2004-09-21; 作者简介:周小梅0959-) .女，湖南保靖人，副教授，研究方向:植物基因工程. 通讯作者:梁爱华.aliang@sxu. edu. cn 周小梅等:农杆菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究 193 200 r/min)24 h 后，取 0.25 mL 的菌液转接于 25 mL 与上述同样的培养基中，在同样的条件下培养 16 h 后，稀释 10~15 倍使其OD O. 5 左右，用于转染子叶柄. 约在 600 取 5 d 苗龄的无菌苗剪