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激光扫描共聚焦显微镜 吴 旭 2009.10.20 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统 激光共聚焦显微镜 概述 激光扫描共聚焦显微镜 （Laser scanning confocal microscope，LSCM） 生物医学领域的主要应用 通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测…… Conventional fluorescence microscope Confocal microscope 历史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。 Confocal microscopy comes of age JG White WB Amos. Nature 328, 183 - 184 (09 July 1987) Zeiss、Leica、Olympus、Nikon 基本原理 相差、DIC 常用荧光标记 共聚焦原理 Differential Interference Contrast (DIC) (Nomarski) 常用荧光探针 Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles 荧光显微镜原理 明场：透射 荧光：落射 落射的优点： 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。 激发光损失小，荧光效应高。 共聚焦原理 由于pinhole的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT探测器探测到，从而提高了成像效果。 通过对样品在x-y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。如果调解焦平面在z方向的位置，连续扫描多个不同z位置的二维图像，则可以形成一个3D图像，3D的重建需要软件的支持。 分光镜组件结构 共聚焦构成 图像相关概念 RGB三基色 图像数据位 亮度 对比度 饱和 分辩率 怎样得到样品图像 样品的标记物有合适的激发波长和发射波长 荧光下观察选择合适的图象 设置激光扫描的通道参数 设置图象的属性 调节每一个通道的亮度、对比度、清晰度、背景亮度 启动 共聚焦和CCD照片的比较 更大的动态范围 高灵敏度 图像背景的消除 灵活的拍照区域选择 ZOOM功能 伪彩色 环境要求高 多通道图象合成 时间序列 Ca离子成像 荧光漂白恢复（FRAP） FRAP：Fluorescence Redistribution After Photo bleaching FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。 LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制。广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域。 荧光共振能量转移（FRET） FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer 能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。 能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移 FRET产生条件： 两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2 供体与受体的距离在2-7nm 供体的发射波长与受体的激发波长一致 应用实例 一、组织光学切片 对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列光学切片。这一功能又被简称为“细胞CT”。 二、三维图像重建 由共聚焦显微镜的组织光学切片功能采集获得的二维图像数据，经计算机图像处理三维重建软件重