原生质体技术.ppt

大型真菌原生质体的制备 1. 原生质体技术的应用 原生质体融合 原生质体单核化 转化（transformation） 生物化学研究 1.1 原生质体融合 主要问题 遗传不稳定 子实体体难形成 优良性状难以表现 1.2 原生质体单核化 （获得单核体，能较好地保持亲本菌株遗传特性） 双孢蘑菇 无性生殖菌株 难以形成子实体的野生菌株 1.3 转化（transformation） 2 原生质体的制备 2.1 影响原生质体制备的因素 菌丝菌龄 酶 稳渗剂 酶解条件 温度 时间 酸碱度 2.1.1菌丝菌龄 菌丝一般以3～5日为宜 鲜嫩菌丝分离原生质体的产率高、活力强，易于再生 菌龄太短生成的菌丝量少 菌龄太长原生质体小且变形多，有时只产生碎片。 使用不同菌龄的菌丝制备原生质体的结果差异很大。 2.1.2 酶 溶壁酶（Lywallzyme） 广东微生物研究所 Novozyme234 丹麦 均为木霉产生的酶系。 2.1.3 渗透压稳定剂　 无机盐类：NaCl、KCl、MgSO4等 有机糖类：甘露醇、蔗糖、肌醇 使用浓度：0.4～0.6mol/L 2.1.4 酶解温度 酶解作用的适宜温度：以30℃为宜 对于各种真菌来说，酶解作用的适宜温度一般高于菌丝的适宜生长温度 温度偏高时，原生质体极易破裂，形成率下降，原生质体也易产生变形，活力下降，甚至破裂，形成率低。 温度偏低时，原生质体形成慢 2.1.5 酶解时间 酶解时间以2-4小时左右 酶解时间一般因菌种类别而异 时间短，形成率低 2.1.6 酶解的pH 多以自然为宜，pH5-6左右。　 2.2　原生质体制备方法 菌丝活化 菌丝液体培养 酶解 原生质体分离 原生质体纯化与镜检 2.2.1 菌丝活化 菌丝接种于PDA培养基上 25℃培养7-10天 2.2.2 菌丝液体培养 菌丝块接种于装有液体MPG培养基的三角瓶中 25℃下浅层静置培养10天， 匀浆器捣碎菌丝，将菌丝悬夜接种于装20mlMPG液体培养基的三角瓶中 25℃下静置培养3-5天。 2.2.3 酶解 取出菌丝体沥干，并用0.6M甘露醇溶液冲洗2遍，用灭菌滤纸吸干。 按0.5g鲜重菌丝加1ml溶壁酶（1-2%，0.6M甘露醇）的比例混合， 30℃下酶解3-4小时， 定时取样镜检，并用血球计数板计算原生质体形成率。 2.2.4 原生质体分离 用装0.5cm厚的脱脂棉注射器过滤，除去菌丝碎片。 滤液经1500rpm离心10分钟，弃上清液。 2.2.5 原生质体纯化与镜检 。 沉淀下来的原生质体用等量稳渗液稀释 可重复离心一次，即得原生质体悬液 ?3 原生质体再生 原生质体悬液稀释成10000个/ ，取0.5ml 于含0.6 M甘露醇的MPG固体培养基中，涂均匀。 25℃下培养10天 备注 1. 原生质体制备过程中，必须有渗透压稳定剂保护，避免原生质体破裂 2. 所有试剂，容器，培养基必须严格灭菌，酶液用0.6M甘露醇溶液配制，再用微孔滤膜过滤除菌。 3. 严格无菌操作，避免杂菌污染 本周实验 实验的前期准备----菌丝培养 （原生质体制备和DNA提取） 1. 制备培养基 土豆（去皮）200g（切片煮汁过滤）蛋白胨 4g葡萄糖 10 g水 1000 ml分装于250 ml锥形瓶，每瓶20 ml，盖上棉塞，盖上报纸，121℃灭菌30min。每组4瓶。 2.接种 用接种针挑取菌种（尽量少带培养基）小心接种于液体培养基表层，每瓶接10块， 3.培养 25℃静止培养10天 * *