免疫实验2幻灯片.pptVIP

* 酶联免疫吸附试验属于免疫酶技术的一种 根据标记对象和检测对象的不同，可以分为多种类型，以其中一种来介绍这种方法的基本原理i： 首先以已知抗原包被酶标板，吸附一定时间后，洗涤未结合的可溶性抗原成分。 在吸附有抗原的酶标板中，加入待测血清，孵育一定时间，使待测血清中的特异性抗体与包被抗原充分反应、结合，之后充分洗涤未与抗原结合的游离抗体成分。 在吸附有抗原抗体复合物的酶标板中，加入针对待测抗体来源种属的酶标二抗（即若待测血清来自人，那么应加入抗人的二抗。免疫球蛋白的免疫原性可以分为同种型、同种异型和独特型，其中同种型抗原决定簇存在于CH和CL区，因此，以某一种属的IgG免疫另一种属，可以获得针对该种属所有IgG的特异性结合的抗体，由于是针对抗体的抗体，将其称之为二抗。在这个试验当中，正是利用二抗的这一特点，用于最后的酶反应显色，因为这样就可以同一种属的同一类抗体制备一个酶标二抗，这一二抗可以用于来自该种属所有同类抗体的检测。 酶标二抗吸附一定时间后，充分洗涤，去除未结合成分。 加入标记酶的相应底物，孵育一定时间后显色。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 碱性磷酸酶（AP） 菌源性AP 肠粘膜AP β–半乳糖苷酶（β-Gal） 用于均相酶 免疫测定 常用酶 酶和酶作用底物 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H2O HRP 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 常用底物 酶和酶作用底物 HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS 常用底物 酶和酶作用底物 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 AP的 底物 β-Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） 经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 常用底物 酶和酶作用底物 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 酶标记抗体或抗原 　酶联免疫吸附试验 　 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 一、基本原理 固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物 三个必要试剂 二、方法类型及反应原理 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E 竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原 + - E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 ELISA检测抗体的方法 捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒