免疫组化的特异性与敏感性.pptVIP

* 第七章. 免疫组化的特异性与敏感性 (The specificity and sensitivity of Immunohistochemistry) I. 特异性 A. 方法特异性: 说明染色结果是由免疫组化反应引起的. B. 血清特异性: 说明染色结果指由抗原抗体反应引起, 即要证明抗原被染色, 又要排除交叉反应问题. II. 特异性与非特异性染色: A. 特异性染色: 由一抗与待检抗原发生特异性免疫反应而产生的染色. 新发现的阳性结果需多次多方法重复实验证实. B. 非特异性染色: 由组织细胞中非抗原-抗体反应引起的染色, 常无结构基础并弥漫存在, 或多次染色的结果相互矛盾. 常见于组织切片的边缘 (边缘效应)或人工损伤部位, 可干扰对特异性染色的观察和记录. III. 对照试验: A. 阳性对照: 证明染色方法和试剂的有效性. B. 阴性对照: 必不可少, 证明染色结果的有效性. 如出现阳性即为假阳性. 1. 空白试验: 用稀释抗体的缓冲液(PBS, TBS等)替代一抗. 2. 替代试验: 用相同稀释度的NGS(与制备一抗的动物种属相同)代替一抗. 使用多克隆抗体时, 阴性对照必需采用替代实验. 3. 阻滞试验: 先用过量的未标记特异性抗体再用标记特异性抗体孵育组织. 4. 吸收试验: 用过量特异性抗原吸收抗血清后再染色. 最有效. 当抗体与组织第一次结合实验或使用一个新抗体时, 必需进行吸收试验. IV. 提高敏感性的方法 A. 增强特异性染色: 1. 选用敏感的方法: 选用PAP法, ABC法和免疫金银法等敏感的方法, 增加抗原上标记物数目, 增加免疫反应产物的量. 2. 增加抗体孵育时间: 高稀释度一抗4℃过夜而非室温2小时. 也可以增加二抗和终抗的孵育时间. 3. 重复抗体或检测试剂层数: a. 重复一抗: 一抗孵育后彻底清洗后再用一抗孵育. b. 重复二抗和PAP复合物(双桥法): 在PAP法中, 用PAP复合物作用后, 先不加底物显色, 重复应用二抗和PAP复合物, 最后再显色. 4. 增加抗原与抗体的接触: 蛋白酶消化, 抗原修复和提高抗体和检测试剂对组织的穿透力. 5. 加强DAB反应产物的着色: a. 锇化: DAB显色后用0.01~1%四氧化锇处理30秒出现棕黑色. 锇化后可用于EM观察. b. 镍加强法: 在0.05%DAB-0.01%H2O2显色液10ml中加50?l 8%的氯化镍(Nickel chloride, NiCI2). DAB反应产物呈紫蓝色. c. 钴镍加强法: 100mg DAB溶于200ml 0.1M, pH7.3的PB中, 逐滴加入5 ml 1%氯化钴(Cobalt chloride, CoCl2), 然后再加4 ml 1%硫酸镍铵(Nickel ammonium sulfate, NiSO4·(NH4)2SO4·6H2O), 孵育切片10~15分, 反应产物为黑色且电子致密. d. 咪唑(Iminazole)加强法: 在DAB显色液中加10mM咪唑(用1M HCl调pH至7.6), 反应产物棕红色. 小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase)阳性神经元, ABC法染色, DAB-H2O2-硫酸镍铵显色. 1994. ABC-HRP-DAB-Ni. Anti-Contactin1. Neuron. e. 镍葡萄糖氧化酶法(GDN): 以葡萄糖缓慢氧化释放的H2O2 来氧化DAB. 加上镍的加强作用, 反应终产物明显增强. *. A液: 硫酸镍铵2.5g, NH4Cl 40mg, β-D-葡萄糖0.2g, 溶于50ml 0.2M pH6.0 HAc 缓冲液. *. B液: DAB 50mg溶于50ml DDH2O; *. 葡萄糖氧化酶: 0.3~0.5mg, 加入新鲜A, B混合液, 显色10~20分. f. 钴-葡萄糖氧化酶法(Co-GOD): 原理同e. 显色前将切片入0.1M, pH 7.6 TB配制0.5%CoCI210分, TB和PB洗. 入含有50mg DAB, 0.2g葡萄糖, 40mg NH4Cl和0.3mg葡萄糖氧化酶的100ml 0.1M pH7.3 PB, 37℃1~2小时, 反应产物深蓝色或黑色. g. 银加强法: DAB氧化多聚物可催化Ag-与还原剂间的反应, 产生金属银以加强DAB着色. *. DAB反应后入20ml浓琉基醋酸(Mercaptor acetic acid), 5ml 37%HCl和75ml DDH2O的混合液中孵育4小时, 以抑制组织对Ag-还原的非特异性的催化. *. DDH2O洗. *. 入新鲜物理显影液(在100ml含0.2g (N