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HIV样品的采集和处理海南省皮肤病医院 检验科 乔凤 主要内容 基本知识 HIV检测方法 抗体检测、抗原检测、核酸检测、耐药检测、CD4+和CD8+T淋巴细胞测定、HIV分离培养 样品的种类 全血、血清、血浆、细胞、唾液、尿液、滤纸干血斑 支持性文件:《全国艾滋病检测技术规范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南》(2006)、《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》(2008)、《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》(卫生部45号令，2006) 基本知识 样品种类 HIV抗体检测：全血、血清、血浆、唾液、尿液、DBS CD4+和CD8+T淋巴细胞测定：抗凝全血 病毒载量检测：血浆 耐药、基因型检测：血浆、DBS 核酸定性检测：全血、血浆、淋巴细胞、DBS 分离培养：全血、淋巴细胞 抗病毒治疗的目标 病毒学目标：最大程度地减少病毒载量，将其维持在不可检测水平的时间越长越好 免疫学目标：维持免疫功能，获得免疫功能重建和/或部分免疫重建 终极目标：延长生命并提高生活质量 病毒载量与CD4+T计数 病毒载量与CD4+T计数 病毒载量与CD4+T计数 HAART的目标 HIV-1病毒载量检测 代表的是病毒的负荷，即体内复制的病毒的数量 体内复制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用血浆中RNA的拷贝数代表HIV的病毒载量 简单来讲是通过测量从而显示每毫升血液里病毒的数量 定量机体内游离病毒的含量 病毒载量检测的意义 急性HIV感染，窗口期复制高峰每毫升血液RNA拷贝可达9×107，一年以后仍然可达2-4×104 判定病人疾病的进程和进展。血浆中病毒水平是病毒增殖和免疫清除机制共同作用的结果，CD4+T细胞越少显示病毒载量水平越高 病毒载量检测的意义 监测与指导抗病毒治疗过程，ART早期HIV RNA水平快速下降，并在相当长的一段时间维持在一个比较平缓的水平，大部分患者可以下降到检测不出的水平 观察耐药性 HIV-1病毒载量检测方法 病毒载量检测主要有三种方法：bDNA、RT-PCR及NASBA NASBA检测是通过核酸释放、提取、核酸扩增(NASBA扩增)及核酸检测来完成对血浆中HIV病毒RNA的定量测定 生物梅里埃公司将NASBA核酸扩增技术与实验时(real-time)检测技术结合起来，“分子信标实时扩增检测技术”，能够对检测进行实时监控，即称为“EasyQ” 病毒载量检测样品采集运输保存 HIV-1，血浆样品 EDTA抗凝真空无菌采血管 全血5ml或3ml*2, 采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过多或不足，会造成血液凝固或被稀释。采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约10次，使血液与抗凝剂充分混匀，避免剧烈振荡导致溶血 病毒载量检测样品采集运输保存 务必在采集全血的4小时内分离血浆，室温下1500-3000r/min离心15分钟 送检血浆2管，每管1ml，冷冻(藏)运输 血浆样本3天内送检可在2-8℃暂时保存，1个月以内应冻存于-20℃以下，1年以内应置于-70℃以下 血浆样品冻融不应超过3次 病毒载量检测结果的解释 单位： copies/ml 检测限： 20 cps/ml(0.5ml)；10 cps/ml(1ml); 100 cps/ml(0.1ml) 结果举例： ＜20copies/ml (检测到HIV核酸，但是低于方法检测下限，无法定量) TND (未检出，使用现有的检测方法对本次样本未检测到HIV核酸) 样品处理对病毒载量结果的影响 一般地讲，血浆中病毒载量水平比血清中的要高出30％～80％ 用EDTA抗凝剂的采血管采集全血后分离血浆样本，其HIV RNA含量比ACD和肝素抗凝管相应含量多10％～15％及20％～25％ 样品处理对病毒载量结果的影响 采集全血后的3-6小时RNA丢失量最大，血浆样本RNA丢失低于全血样本。1小时以内，EDTA抗凝管RNA丢失约10％ ，ACD抗凝管丢失约20％；6小时以内，肝素抗凝管RNA丢失约30％。 样品处理对病毒载量结果的影响 血浆样本在-20℃冰柜保存3-14个月，与起始病毒载量水平值(0月)相比，3个月时变化没有显著性差异；6个月后下降值明显，有随着保存时间延长病毒载量水平下降幅度越大的趋势。在-20℃冰柜内保存6个月，样本病毒载量水平已不能真实反映样本采集之初的水平，对疾病进展和疗效评价，尤其对回顾性研究已无指导意义。 样品处理对病毒载量结果的影响 -20℃条件下冻融3次比冻融1次HIV RNA降低约20％。 许多研究者用多种检测方法和不同人群样本的研究结果证实，技术和生物因素对样本RNA水平的影响是持续的和可预测的，大约在0.3-0.