第5章体细胞胚胎发生.pptVIP

第5章 体细胞胚胎发生 1. 体细胞胚胎发生的概念 1.1 胚状体（embryoid，非合子胚） 在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体（图4－1）。 1.2 体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis） 由单细胞（体细胞）或一群细胞被诱导不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程称为体细胞胚胎发生。 发生过程见图4－2（p61)。 Kohlenbach关于胚的分类: (1)合子胚：由受精卵或合子形成的胚。 (2)非合子胚：由合子之外的细胞形成的胚。 体细胞胚—由孢子体细胞（除合子外）离体培养形成的胚。 非体细胞胚—即指芽、短枝、愈伤组织、花粉胚、块茎、球茎等繁殖体。 孤雌生殖胚—由未受精卵形成的胚。 孤雄生殖胚—由雄配子体（小孢子花粉粒）形成的胚。 2. 体细胞胚胎发生的途径 直接途径：指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段(图4－3 A，图4－3 B)。 这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已“决定”了的。 间接途径：指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎 (图4－3 C)。 多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。它通常分两个阶段完成： ①胚胎发生丛（embryogenic clump，EC）的形成。 ②胚状体的发育。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。 关于体细胞胚胎的起源： 体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞，目前仍然有争论。但研究结果发现，绝大多数体细胞胚起源于单细胞（例子？）。但也有人认为它们起源于一个以上的细胞（证据？） 体细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现遗传信息的表达。 3. 影响体细胞胚胎发生的因子 对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中的两种成分，即生长素和氮源。 3.1生长素 例子1：胡萝卜体细胞胚的发育（p65～66） 结论：在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。因此，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的“诱导培养基”。 例子2：咖啡体细胞胚的发育（p66） 例子3：对甜橙驯化愈伤组织的详细研究，也证实了生长素对胚胎发生的重要作用（p66～67） 。 最终结论：对于离体条件下体细胞胚胎发生来说，一个最低限度的内源或外源生长素是必不可少的。 成功诱导体细胞胚胎发生的步骤： 第一步，在生长素浓度高(2,4-D 0.5～1 mg／L)的培养基（增殖培养基）上诱导和增殖愈伤组织，高浓度生长素诱导愈伤组织局部细胞形成的分生组织细胞，称为胚性细胞团(EC)。 第二步，将EC转移到极低水平生长素(0.01～0.1 mg／L)或完全无生长素的培养基（胚发育培养基）上，EC发育为成熟胚胎。 其它激素的作用： 细胞分裂素：BAP可促进胡萝卜愈伤组织的细胞分裂，但抑制它的成胚潜力；ZT促进；咖啡叶片愈伤组织要求激动素与生长素比例高。 赤霉素：能抑制体细胞胚胎发生 3.2 氮源 除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著影响离体条件下的胚胎发生。体细胞胚诱导和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵盐。 例子 1：野生胡萝卜体细胞胚诱导 例子 2：栽培胡萝卜体细胞胚诱导 培养基中还原态氮和硝酸盐(NH4Cl＋NO3－)组合似乎更有利于许多培养体系的体细胞胚胎诱导。 欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有一个最低数量的内源NH4＋存在(每千克鲜重的组织约5 mmol)。如果内源NH4＋达不到这个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要使细胞内NH4＋达到这个水平，不但需要有很少量的外源NH4＋存在(2.5 mmol／L)，还需要供应相对浓度很高的NO3－(60 mmol／L)。 虽然对于胚胎发生来说，其他形式的还原态氮都不如NH4＋有效，但水解酪蛋白、谷氨酰胺和丙氨酸等也可用做可靠的代替品。 3.3 其他因子 钾的浓度：在野生胡萝卜中，高浓度的钾（20 mmol／L）是胚胎发生所必需的。 溶解氧的含量：培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值（1.5 mg／L）。 活性炭：培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率 。 某些挥发性和非挥发性物质：抑制愈伤组织中的体细胞胚胎发生。 4. 体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学 在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中存在着两种类型的细胞： ①自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，一般不具胚胎发生潜力。 ②成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细胞，具成胚潜力。 5.体细胞