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■显色互补筛选法 LacZ’基因的蓝白斑筛选 ■形成嗜菌斑筛选法 对于λDNA载体系统,只有在外源DNA插入载体后,重组的λDNA分子大小在野生型λDNA分子的78%-105%范围内时,才能在体外包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。后者在转导受体菌后,转化子在培养基上被裂解形成嗜菌斑,而非转化子能正常生长,两者很容易区分。 2.DNA电泳检测法 ■直接电泳检测法 重组的质粒DNA分子由于有外源DNA的插入,比未插入外源DNA的质粒载体大,通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。 ■酶切电泳筛选法 通过直接电泳检测法筛选出来的重组子,插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通过将重组子中的质粒进行酶切,然后再进行电泳,就可将阳性克隆子筛选出来。 ■PCR检测法 外源DNA的两侧序列多为已知序列,通过PCR扩增外源DNA,然后对扩增产物进行电泳,就可筛选出阳性克隆子。 3.核酸分子杂交检测法 4.免疫化学检测法 基本过程与核酸分子杂交检测法相似,不同的是该法使用抗体探针,而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提 条件是克隆基因可在宿主细胞内表达,并且有目的蛋白的抗体。 ■放射性抗体检测法 ■免疫沉淀检测法 ■酶联免疫检测法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 采用非放射性标记物(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)偶合第二抗体,然后与目的蛋白抗原-抗体复合物结合,通过检测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。 5.转译筛选法 转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法,可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。 ■杂交抑制转译 要求:被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。 原理: DNA 蛋白质 mRNA 蛋白质 × 杂交 转化菌落 提取重组DNA 与总mRNA杂交 形成DNA-RNA杂种分子 将总mRNA(包括DNA-RNA分子)提取出来 体外转译 蛋白电泳放射自显影 总mRNA 体外转译 蛋白电泳放射自显影 经对比,(1)比(2)中少了一种蛋白质 找到一种转译作用被抑制了的mRNA 筛选出重组菌落(或噬菌斑) 步骤: (1) (2) (3) ■杂交选择转译 重组体库 提取DNA 固定在NC膜上 与mRNA或总RNA杂交 目的基因与对应的mRNA杂交,mRNA固定在NC膜上 将分离的mRNA进行体外转译 凝胶电泳或生物活性检测 找出单菌落重组体 6.DNA-蛋白质相互作用筛选法 原理: 外源DNA 蛋白质 能与某一特定DNA序列结合 作为探针与克隆群体杂交 翻译 克隆载体+外源DNA 受体细胞 导入 转化子 非转化子 含有克隆载体 或外源DNA 不含有克隆载体 或外源DNA 重组子 非重组子 仅含有克隆载体 含有克隆载体 +外源DNA 阳性克隆子 含有外源目的DNA 非阳性克隆子 含有外源其他DNA 图6.4 转染(转化、转导)后不同类型的宿主细胞 滤膜(固定抗体) + 图6.5 放射性抗体检测法 图6.6 放射性抗体检测法 加入目的基因产物的标记抗体 转化菌落 不含有目的基因 含有目的基因 涂板培养 抗原-抗体反应,菌落周围出现沉淀素 图6.7 免疫沉淀检测法 人有了知识,就会具备各种分析能力, 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书,广泛阅读, 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍,我们能丰富知识, 培养逻辑思维能力; 通过阅读文学作品,我们能提高文学鉴赏水平, 培养文学情趣; 通过阅读报刊,我们能增长见识,扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操, 给我们巨大的精神力量, 鼓舞我们前进。 * 第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选 第一节 受体细胞 受体细胞(receptor cell):又称宿主细胞或寄主细胞(host cell),从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 随着基因工程的发展,从低等的原核细胞,到简单的真核细胞,进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。 1.受体细胞的概念 2.受体细胞选择所应遵循的原则 便于重组DNA分子导入。 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。(如:限制性内切酶缺陷型,避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。) 便于重组体的筛选。(选择与载体所含的选择标记相匹配的受体细胞基因型) 遗传稳定性高,易于扩大培养或发酵生长。 安全性高,无致病性,不会对外界环境造成生物污染。 选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞,利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累,或促进外源基因的高效分泌表达。 受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。 具有较好的转译后加工机制,便于真核目的基因的高效表达。
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