MTT比色试验、克隆形成试验.pptVIP

常用测定细胞增殖能力的实验方法：MTT比色试验、克隆形成试验 常用测定细胞增殖能力的实验方法 活细胞计数法：费时，有一定主观性 MTT比色法：简便，大样本、灵敏度较高，重复性好 结晶紫染色法：与MTT法类似，但步骤多 克隆形成法：反映干细胞增殖能力，周期长 流式细胞术：细胞周期分布，成本高 同位素掺入法：3H-TdR, 125I-UdR掺入DNA，反映S期细胞活性，精度最高，但有放射性 ATP生物发光法：灵敏度高，与MTT法类似 MTT比色试验 原理 MTT比色试验步骤 接种: 细胞密度103~105/ml, 体积100~200l 培养: 37℃、5％CO2、饱和湿度，培养24h 施加干预因素：培养适当时间（1-5d） 呈色: 终止培养前4～6h，每孔加5mg/ml MTT 20 l，继续培养 溶解: 每孔加DMSO150 l，振荡5min 比色: 492nm波长，测定光吸收值（A） 绘制曲线：以细胞数或作用因素（如药物浓度）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制曲线 MTT ASSAY Cell suspension 105/ml 3.2× 104/ml 104/ml 0.32ml 0.1ml Medium 0.68ml 0.1ml 0.9ml 0.9ml 3.2× 103/ml 3.2 × 105/ml 0.9ml 0.1ml MTT ASSAY MTT ASSAY 103 3.2×103 3.2×104 104 105 MTT比色试验注意事项 培养板：贴壁型细胞－平底培养板 悬浮型细胞－U型培养板 细胞密度：不同细胞须选择适当的密度 MTT溶液：4℃避光保存，出现结晶时弃去；部分细胞需摸索MTT作用最佳浓度和时间 残留血清和培养液会影响吸光值 注意控制吸光值与细胞数之间线性范围，一般为102～105 MTT比色试验应用举例 药物敏感性试验 生物材料细胞毒测定 放射效应测定 冷冻杀伤效应测定 高温杀伤效应测定 激光效应测定 磁场效应测定 补体依赖性细胞毒测定 克隆形成试验 概念：克隆指单个细胞在体外持续分裂繁殖6代以上，其后代所组成的细胞群。光镜下，大于50个细胞，计数为1个克隆。 方法： 1.平皿克隆形成试验: 适用于贴壁型细胞，如正常细胞或肿瘤细胞；控制细胞迁移 2.软琼脂克隆形成试验: 适用于肿瘤细胞、转化细胞和悬浮生长细胞；无细胞迁移；底层为0.5%琼脂，上层为0.3%琼脂(含细胞)。 用途：多用于药物、放射敏感性试验。 平皿克隆形成试验 软琼脂克隆形成试验 MTT实验实习 2人为1组，每块96孔板共4人操作 预先接种细胞数: 103、3.2×103 、 104 、 3.2 × 104 、 105/0.2ml/孔 预先常规培养 预先加入MTT0.02ml, 孵育6h 吸出上清液，加入DMSO 0.2ml,振荡5` 490nm比色，手工记录吸光值 绘制曲线，纵轴（A），横轴细胞数 要求交实验报告，包括姓名、学号、实验名称、目的、原理、方法和结果。实验报告计入成绩 MTT ASSAY