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第七章 萃取双水相萃取
第七章 双水相萃取 主要内容 一、概述 二、物质在两相中的分配 三、双水相萃取工艺流程 四、双水相萃取技术的应用 五、思考题 一、概述 过滤和离心技术(取决于分离颗粒的尺寸或密度差异)难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、提取和浓缩胞内物质的操作。 萃取已广泛用于液液分离,但一般的有机溶剂萃取难于分离蛋白质? (1)许多蛋白质有极强的亲水性,不溶于有机溶剂; (2)蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。 在一定条件下,水相也可形成两相甚至多相。将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中成为可能。 1、最早的双水相萃取现象: 1896年Be jerinck,把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合,可分为两相,聚合物之间的“不相溶性”。 2、优势 (1) 条件温和,保留产物活性 (2) 含水量高,表面张力低,耗能少 (3) 大分子及小分子(红霉素、氨基酸 等)都可萃取 (4) 易于放大 3、双水相体系形成 聚合物混合时,是分层或成一相,取决于分子间的作用力: 分子间作用力,与分子量有关,分子量越大,分间作用力也越大。 分子之间作用力:(1)A-A A-B 相分离(2)A-AA-B 混合(3)A-BA-A 凝聚复合 4、双水相体系类型 二、物质在两相中的分配 2、影响分配的因素 (2)体系中无机盐离子的影响 无机盐离子在两相中的分配不同,会导致两上中的电位差。 (3)体系pH值的影响 蛋白质的离解度——改变蛋白质的电荷——改变分配系数。 缓冲物质磷酸盐的离解度——改变电位差——分配系数。 pH的微小变化会使蛋白质的分配系数改变2-3个数量级。 (4)体系温度的影响 温度的变化——分配率——蛋白质的生物活性。 聚合物的多元醇或多糖结构对蛋白质有 保护作用,增加了蛋白质的稳定性,故可 在室温一操作,且一般温度变化不大。 (5)体系中微生物的影响 影响:上下相体积、胞内蛋白的分配系数。 三、双水相萃取工艺流程 1、双水相系统的选择 相系统应易于用静置沉降或离心沉降法进行分离。 对胞内蛋白萃取,使碎片分配于下相中,来增大两相的密度差,达到快速分离,降低操作成本和操作时间。 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质的差别,来选择萃取目标产物。如调pH、添加盐、提高成相系统的浓度(系线长度) 双水相萃取过程放大较容易,一般10mL刻度离心管内结果即可直接放大到产业化规模。具体的实验步骤: 配制一系列不同浓度、pH值及离子强度的双水相,每个双水相改变一个参数。 加入料液后,再加水使整个系统的质量达到5-10g。离心管封口后充分混合。(反复倒置或涡旋混合器) 在1800-2000g下离心3-5min,分相。 分别吸出上下相,测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性,计算分配系数。 分析目标产物的收率和纯化倍数,确定最佳双水相系统。 2、相平衡与相分离 相平衡:双水相系统的表面张力很小,相间混合所需能量很低,通过机械搅拌很容易分散成微小液滴,达到相平衡所需时间很短,一般只需几秒钟。 相分离:重力沉降(静置分层)或离心沉降法。 3、多步萃取 4、大规模双水相萃取 双水相放大后,溶质的分配系数和相体积比保持不变,溶质的浓度随匀浆液的加入量线性增大。 四、双水相萃取技术的应用 目前广泛应用于蛋白质的分离与纯化。 1、胞内酶提取: 一般是破碎细胞(匀浆液粘度大,碎片很小)—— 离心分离(能耗大,且碎片不易清除干净) 双水相萃取(易除去碎片,同时使酶得到精制) 目前应用最多的是PEG/盐体系。酶主要分配在上相,碎片在下相或界面上,收率 能达到90%;料液中湿细胞浓度可达30%,分配系 数在3-20之间。如下表 例子:以甲酸脱氢酶(FDH)的分步提取纯化来进一步说明胞内酶的提取。 2、核酸的分离及纯化 3、人生长激素、β-干扰素的提取 用PEG4000 6.6%/磷酸盐14%体系从大肠杆菌提取。 4、病毒的提取、纯化 5、生物活性物质的分析检测 何谓双水相萃取? 在一定条件下,水相可形以成两相。将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相的过程。 双水相体系可分为那几类?目前常用的体系有那 两种? 两种都是非离子型高聚物(PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等) 其中一种是离子型高聚物(羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX) 两种都是离子型高聚物(羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠) 其中一种是无机盐(磷酸盐、硫酸盐等)( PEG /硫酸盐) 双水相萃取的优点? (1) 条件温和,保留产物活性 (2) 含水量高,表面张力
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