第七章凝胶过滤.ppt

第六章 凝胶过滤 凝胶过滤（又叫分筛层析）是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。 其原理是： 凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物却被排阻在外部; 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。 凝胶过滤特点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等。 常用于： 分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物； 还可用于: 测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面。 第一节 凝胶的分类及性质 凝胶是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。 这化合物目前主要有： 葡聚糖凝胶 天然琼脂糖 交联琼脂糖 其次还有： 聚丙烯酰胺凝胶(生物胶Bio-gel) 交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶 交联琼脂糖与葡聚糖共结合的凝胶 (superdex) 详见表6-1。 一、葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex。 它是由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1,2环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而成的。 其结构式如图6-1所示。 在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 1．理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。 它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异： 膨胀度(床体积) 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 筛孔的大小 分级范围 葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样，详见表6-2。 以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。 以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。 2．稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。 在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。 3．吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含10~20μg当量的羧基基团所致。 羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。 这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。 因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。 新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响(虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时,需预层析)。 此外；葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用， 若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理。 二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。 琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。 琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％)和6B(6％)。 Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是