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第三章— DNA测序技术 人类基因组计划 人类基因组计划（Human genome project）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。 美国担了54%，其次是英国，承担了33%，日本为7%，法国为2.8%，德国为2.2%。 二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成 华大基因于2007年10月完成了第一个中国人的高质量基因组图谱——“炎黄一号” 2008年1月12日由中国、英国和美国的科学家在深圳、伦敦和华盛顿同时宣布国际“千人基因组计划”正式启动。最终目标是获得欧、亚、美、非各洲不同人群中2500人的基因数据。 大熊猫基因组-2010.1 “大熊猫基因组”项目于2008年3月启动。研究表明，大熊猫有21对染色体，基因2万多个。 　破解古人类基因组-2010.2 人体肠道菌群元基因组-2010.3 2009年4月启动了“世界三极动物基因组计划” 2009年8月启动了“万种微生物基因组计划”。 2010年1月启动了“1000种动植物基因组计划”，计划未来两年内为一千种重要动植物进行测序，并从科学界征集测序物种的提案。 解读生命的天书-DNA测序 （一）化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert,1977 ) （二）双脱氧链末端终止法 (Sanger,1977) （三）DNA自动化序列分析 一、化学降解法测序的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 二、双脱氧链终止法（Sanger法） Sanger法是在反应体系中加入 2’, 3’ -ddNTP，由于其没有 3’-OH 而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止。 在PCR时加入标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基） ddX的两个作用： 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接 电泳 谁终止，碱基就是谁 此方法获1980年的Nobel奖 序列识读 自下而上，5’ 3’ 所读序列为模板的互补链 三、 DNA测序自动化和大规模测序 特点: 原理同sanger法 标记物为荧光染料（与双脱氧核苷三磷酸共价相连) 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 DNA自动测序步骤： 4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs 第一步：加入复制终止剂 第二步：荧光检测 DNA自动测序与手工测序的不同点 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑 全自动的测序仪器：MegaBace 基因组测序：两种方案 DNA片段在染色体上的位置、方向已知。首先染色体被打断成150kbp左右的片段，然后克隆到BACs中，再进一步打碎，克隆，测序，组装。 “鸟枪法”，shotgun，随机将DNA片段打碎，克隆，测序，组装。DNA片段在染色体上的位置和方向未知。 三大数据库之间的联系 GenBank中测序最多的20个物种 Sanger测序反应 反应产物毛细管电泳分离 激光激发、荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。 荧光检测探头 电泳，看谁跑得快 序 列 图 谱 * * * * 20世纪人类科技发展史上的三大创举 90年代人类基因组计划 40年代曼哈顿原子弹计划 60年代阿波罗登月计划 2000年6月公共领域测序计划工作框架图 2002.11 2004.12 水稻和鸡基因组 人基因组 “萨卡克(Saqqaq)”的人类群体，约在4750年前至2500年前居住于格陵兰岛，其后灭绝。 Saqqaq古人的遗传信息比公认的美洲原住民(主要是印第安人和因纽特人，同属黄种人)更加接近于现代东亚和西伯利亚人群。 收集了124个来自于欧洲人肠道菌群的样本, 这个基因集中包含了绝大部分目前已知的人体肠道微生物基因,但更多的是目前未知微生物的基因。 从这个基因集中可以估计人肠道中存在约1000到1150种细菌,平均每个体内约含有160种优势菌种,并且这些细菌是绝大部分个体所共有的。