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哮喘患儿调节性B细胞改变及意义初探 　　【摘要】 目的：探?调节性B细胞（Regulatory B cells，Breg）在儿童哮喘发病中可能的作用。方法：选取急性期哮喘患儿23例（试验组），同龄健康儿童21例（正常对照组），取血备检。采用流式细胞术分别检测外周血调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg）、Breg比例及Breg细胞表面CD80、CD86的表达水平；PCR检测CD4+ T细胞中IL-17A、IL-17F IFN-γ、T-bet、GATA3、RORγt、IL-10、TGF-β mRNA表达；ELISA检测B细胞培养上清中IL-10浓度。结果：（1）试验组患儿急性发作期外周血中CD24hiCD27+Breg细胞比例及B细胞培养上清的IL-10浓度均比正常对照组低（P0.05）。（3）CD19+B细胞中IL-10 mRNA在试验组和对照组差异无统计学意义（P0.05），而TGF-βmRNA在试验组患儿中升高，差异有统计学意义（P 　　【Key words】 Asthma； Child； Regulatory B cells； Regulatory T cells； Interleukin-10 First-author’s address：Shenzhen Childrens Hospital，Shenzhen 518026，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.004 支气管哮喘是一种反复发作的咳嗽、喘息、胸闷及呼吸困难为表现的慢性气道炎症性疾病，全国城市14岁以下哮喘儿童的累及患病率由2000年的1.97%增至2010年的3.02%[1-3]。儿童哮喘在我国占儿科门诊量的3%～5%，是危害儿童健康的一种重要疾病[4]。支气管哮喘，简称哮喘，是由气道内的炎症细胞、结构细胞和细胞组分共同参与的慢性炎症性疾病，但其病因及发病机制迄今为止仍未完全阐明。以往的观点认为Th1/Th2细胞免疫失衡是哮喘发病的重要环节，但是随着研究的不断深入，Th1/Th2细胞平衡理论未能解释一些实验及临床现象[5]。体内存在具有免疫调节（或免疫抑制）功能的调节性B细胞（Breg），可通过细胞共刺激分子（CD80、CD86）或细胞因子（IL-10或TGF-β）抑制自身免疫T细胞活化，其数量或功能变化可引起自身免疫功能紊乱，导致免疫性疾病的发生[6-9]。本文探讨哮喘患儿急性发作期外周血Breg改变，为进一步揭示哮喘免疫发病机制提供理论基础及实验依据，现报道如下 1 资料与方法 1.1 一般资料 哮喘试验组：选取2015年 10月-2016年5月深圳市儿童医院呼吸专科诊断支气管哮喘急性期患儿23例，其中男17例，女6例，男女比例为2.83∶1；年龄3～12岁，平均（6.58±2.38）岁。诊断均符合2008年由中华医学会儿科分会呼吸学组制定的哮喘诊断标准，均为首次确诊哮喘或规范吸入激素且停用3个月后复发，没有其他传染病和自身免疫病。正常对照组：选取在深圳市儿童医院2015年10月-2016年5月体检的健康儿童21例，其中男7例，女14例，男女比例为2.00∶1；年龄2～10岁，平均（5.43±1.91）岁。经统计分析，两组年龄、性别组成比较，差异均无统计学意义（P0.05），具有可比性。本研究方案及步骤经深圳市儿童医院学术伦理委员会讨论通过，参与研究的受试者或其监护人均签署知情同意书 1.2 分离CD4+、CD19+B 淋巴细胞：无菌采取静脉血3 mL，肝素抗凝，迅速送检。聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺分离外周血单个核细胞（PBMC）。参照试剂盒（美国LifeTec公司，113.31 D和111.43 D）方法，磁珠分离法分离CD4+、CD19+B淋巴细胞，检测细胞活力95%，纯度97%，备用 1.3 流式细胞术检测（flow cytometry，FC） 采用全血直接计数法，以CD19-eFluro450（流式抗体均购自美国eBioscience公司）设门，经CD24-PerCP-Cy5.5、CD27-PE-Cyanine7、CD80-APC、CD86-FITC、CD1d-PE染色30 min后检测，分析CD19+CD24+CD27+Bregs比例及CD80、CD86、CD1d平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。另取部分细胞，以CD4-FITC设门，固定、破膜，经CD25-PE和Foxp3-APC抗体染色30 min，检测CD4+ CD25+Foxp3+细胞比例。全部数据经流式细胞仪（美国Bection Dickinson公司，CantoII）配套?件DivaVer6.1.3获取分析 1