gp130与系统性红斑狼疮的基因治疗.pptx

系统性红斑狼疮与gp130调控的IL-6/可溶性IL-6受体复合物的信号传导及其基因治疗 系统性红斑狼疮——严重危害人类健康的自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮(SLE)是由于遗传、激素及环境相互作用引起一种自身免疫病 累及皮肤、关节、肾脏、心血管、神经和黏膜等多个系统器官 临床表现复杂，病程迁延反复，在我国患病率接近1/1000 10年生存率虽已达84%，但由于发病时年龄较轻，患者平均寿命仅44岁 IL-6简介： IL-6是一种由单核/巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞、Th2细胞和B细胞产生的细胞因子。主要生物学活性包括：促进B细胞增殖分化和产生抗体；促进CTL、NK的分化并增强杀瘤活性；促进肝合成急性期蛋白；作为内源性致热源，参与炎症反应。 IL-6异常与系统性红斑狼疮： SLE病人的B细胞可自发产生大量IL-6，而正常人的B细胞几乎不产生IL-6。在SLE病人中，B细胞主要由IL-6刺激分化与增殖。SLE病人B细胞同时表达IL-6高亲和力受体（IL-6 Receptor,IL-6R），组成一个自分泌刺激环，促使B细胞多克隆活化。IL-6还能诱导SLE病人B细胞产生抗DNA抗体，这是SLE的特征抗体之一[1]。IL-6的简要致病机理如下图： IL-6与系统性红斑狼疮 B细胞 IL-6 IL-6R 复合物 抗DNA抗体 IL-6/IL-6R复合物的信号传导通路与gp130 gp130分子是分子量为130 kD的糖蛋白，是白介素-6(IL-6)的信号传导链。IL-6和IL-6受体(IL-6R)结合后，并不引起信号的跨膜传递，还必须与二个gp130分子结合，使之发生同二聚体化，导致细胞浆内Jak激酶的活化，引起信号传递[1]。IL-6/IL-6R的信号传导链如下图所示： 抑制gp130下调B细胞活化的尝试 可溶性gp130（soluble gp130, sgp130） 细胞因子受体有膜蛋白和可溶性蛋白两种形式，大多数细胞因子受体的可溶性表达都能起到竞争性抑制细胞因子与膜蛋白受体结合的作用。因此，研究人员已尝试过用sgp130竞争性阻断IL-6/IL6R复合物刺激B细胞分化增殖的信号传导[1]。 复合物 gp130 B细胞 sgp130 gp130抗体 gp130抗体能与细胞膜表面的gp130发生特异性结合，阻止复合物与gp130结合[2]。 gp130抗体 复合物 gp130 siRNA：未见过用gp130的siRNA沉默gp130来治疗SLE的尝试，但研究表明gp130的siRNA确实可以大大降低细胞膜表面gp130受体的数量[3]，进而抑制B细胞的活化。 siRNA技术的原理和应用 siRNA，即小干扰RNA，是一段长约20个碱基对、与靶标基因高度同源的双链RNA. siRNA进入细胞内部后，可引起与其同源的特异基因mRNA降解，进而抑制这段基因的表达，属于转录后抑制。siRNA的发现者获得了2006年诺贝尔奖，并被《科学》杂志连续两年评为十大科技进展之首。siRNA的基因沉默机理如下图： 用于基因治疗的siRNA载体 基因载体的选择——化学、材料学与生物学问题： 病毒类基因载体：最早进入临床试验和药物研发的基因载体，目前在基因治疗中仍占有不小的比例。 优点：转染率高、基因表达时间持久。 缺点：安全性受到质疑，运载的基因片段长度有限，制备复杂，成本昂贵。 非病毒基因载体：最近十年开始受到广泛关注，潜力巨大。 优点：无免疫原性，外源基因整合到核基因中的概率极低，制备简单，成本较低。 缺点：转染率低于病毒载体。 本实验中拟采用非病毒基因载体。设计一种非病毒基因载体，将gp130的siRNA安全、高效地转入动物模型体内，实现基因治疗。 用于基因治疗的siRNA载体 非病毒载体的研究工作超出了基础医学的范畴，所以该项目需要化学、生物学和基础医学专业的学生合作完成。浙江大学化学系09级本科生胡天楠师从汤谷平教授，已开始着手合成用于SLE的基因治疗的非病毒基因载体。他将要合成的载体是PHPA-PEI，其安全性和运载目的基因的能力已被相关研究证实[1]。这是世界范围内，聚阳离子型非病毒基因载体在SLE的基因治疗中的首次尝试。该项目日前已被批准获得2011年全国大学生创新创业训练计划（国创）的资助。下图是PHPA-PEI的结构式。 实验设计部分 1.用gp130的siRNA在体外研究其对红斑狼疮中B细胞活化的影响 从sigma试剂公司或GeneBank数据库中获取gp130的siRNA序列，并交由生物技术公司，扩增获得转录后能得到相应siRNA的质粒载体（以下简称siRNA质粒）。取SLE小鼠（NZB/NZW品系）骨髓细胞，分离纯化，得到B细胞，经传代培养后得B细胞系。 分别用siRNA质粒和空白对照处理B细胞，用westernbl