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氨基隐性孔雀石绿抗体制备及ELISA方法建立 　　摘要：以N，N-二甲基苯胺、对硝基苯甲醛为原料，合成改造了氨基隐性孔雀石绿半抗原，并通过紫外、红外、质谱鉴定。结果表明，氨基隐性孔雀石绿半抗原改造成功。采用重氮化法合成了氨基隐性孔雀石绿人工抗原，并通过紫外光谱进行鉴定，结果显示偶联蛋白成功。免疫大白兔制备了隐性孔雀石绿抗体，抗体效价达6.4×104。建立了隐性孔雀石绿ELISA方法，最低检测线为0.1 μg/L 关键词：孔雀石绿；隐性孔雀石绿；抗体；ELISA 中图分类号：O657.7+3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）07-1340-05 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.036 Preparation of Antibody of Amino-Leucomalachite Green and Development of ELISA Method CHANG Chao， ZHANG Jia-yan， CHENG Shi-jie， WU Jin-e （College of Food Science and Technology， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China） Abstract： With N，N-dimethylanilin and p-nitrobenzaldehyde as raw materials，the hapten of amino-leucomalachite green （NH2-LMG） was synthesized and then was identified with ultraviolet，infrared and mass spectrum. The results showed that the artificial antigen of NH2-LMG was successfully synthesized by diazotization method and was identified by ultraviolet spectrum，which indicated the success of the coupling protein. The antibody of NH2-LMG was prepared with immune New Zealand white rabbits，and the antibody titer reached 6.4×104. The ELISA method was developed， with the limit of detection of 0.1 μg/L. Key words： malachite green； leucomalachite green； antibody； enzyme-linked immunosorbent assay 孔雀石绿（Malachite Green，MG）是合成的三苯甲烷类染料，因具有高效广谱杀菌作用而曾广泛应用于水产养殖行业。然而，孔雀石绿在水生动物体内会被代谢成隐性孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG），其代谢产物被视为残留标示物，孔雀石绿（图1）和隐性孔雀石绿（图2）具有致畸致癌致突变的毒性[1-4]，包括中国在内的许多国家都已严禁使用。但由于其价格便宜，违禁使用的事件屡有发生，给人类的健康带来巨大的隐患。目前，国内外对三苯甲烷类物质的检测主要运用色谱技术，如HPLC、LC-MS等[5-10]，中国颁布的检测标准SN/T 1479-2004和GB/T 20361-2006[11，12]也主要采用仪器方法。仪器方法虽然灵敏度高、准确性好，但需要昂贵的仪器，样品处理复杂，不适合大量样品的筛选。酶联免疫吸附测定法（ELISA）因具有快速、灵敏、高效等优点，用于大批量药物残留筛选越来越广泛。国内外已经开始研发隐性孔雀石绿ELISA方法，但在半抗原改造时大多数是在苯环引入羧基[13-18]。为了能够筛选出更灵敏的抗体，本试验设计在苯环上引入硝基，并运用紫外、红外和质谱对半抗原改造进行鉴定，采用重氮化法合成人工抗原，并对抗体进行筛选，建立了隐性孔雀石绿ELISA方法，为开发更灵敏的隐性孔雀石绿试剂盒奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物 2月龄雄性健康新西兰大白兔，体重1.5±0.5 kg，购于湖北省疾病预防控制中心 1.1.2 试剂 对硝基苯甲醛、N，N-二甲基苯胺、二甲基亚砜等，国药集团化学试剂有限公司上海分公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全