TCB7-5细胞毒性遗传毒性的检测及应用.pdfVIP

细胞毒性、遗传毒性的 检测及应用 Outline 细胞毒性检测（Cytotoxicity） 遗传毒性检测（Genotoxicity） 应用举例 一、细胞毒性检测 细胞毒性可从细胞形态、细胞生长情况及其生化改变 来评价。常用指标分为以下几类。 （1）细胞数量多少的指标：每孔细胞蛋白质含量、 每孔细胞DNA含量、活细胞计数、结晶紫试验、 中性红试验、MTT试验和WST-1试验。 （2 ）细胞膜完整性或通透性的指标：台盼蓝拒染率、 乳酸脱氢酶漏出率等。 （3 ）亚细胞器损伤的指标：中性红试验（溶酶体）、 MTT试验和WST-1试验（线粒体）。 （4 ）细胞代谢活性的指标 ：①反映细胞能量代谢： ATP含量、乳酸／丙酮酸比值。②反映氧化还原状 态：还原型谷胱甘肽 （GSH ）含量、脂质过氧化产 物生成量。③反映生物大分子合成状况：蛋白质合 成量、DNA合成量。 （5 ）形态学改变的指标：细胞形态变化、细胞核和 细胞质的改变、细胞空泡积累、脂质小滴、细胞膜 膨出 （鼓泡）、细胞核染色质的变化及细胞器 （如 线粒体、溶酶体等）的变化、细胞脱壁和贴壁等。 另外还有将几种指标结合起来反映不同损害靶 点的联合检测法，如WST-1试验、中性红试验，可 对同一细胞样本先后进行检测，以分别检测细胞的 线粒体损伤和溶酶体损伤。 指标的具体选择除了要考虑到应与体内诱导的 损害相符外，还要注意以下几个方面：可靠性、可 重复性、灵敏度、方便性、费用大小及种属差异， 最后还要考虑检测的化学物毒作用特点。 （一）乳酸脱氢酶（LDH）漏出率的检测 (一)原理 乳酸脱氢酶 （LDH ）系胞质酶，正常情况 下不能透过细胞膜，但当细胞受到损伤时， 细胞膜通透性增强，LDH会从细胞质内漏 出，细胞质内LDH减少，培养液中LDH增 多，测定培养液中LDH活性或漏出率可以 反映药物的细胞毒性。 LDH在有辅酶I携带氢的情况下，催化乳酸 与丙酮酸之间的可逆反应。以乳酸为基质， 在pH10的条件下，经LDH作用后，测定生 成的丙酮酸量，从而推知LDH 的活性。 （二）材料 1．96孔培养板培养的待测细胞与对照组细胞。 2 ．0.1 mol/L甘氨酸缓冲液 甘氨酸7.505 、NaCl 5.85 ，经蒸馏水溶解 后稀释至1000 ml。 3 ．缓冲基质液（pH 10.0 ）70 ％乳酸钠溶液10 ml、0.1 mol/L甘氨酸缓冲 液125 ml、0.1 mol/L NaOH 75 ml，加氯仿数滴防腐，置于冰箱中保存 待用。 4 ．辅酶I溶液辅酶I 10 m ，加蒸馏水2 ml ，溶解后置于冰箱中保存待用。 5 ．2,4-二硝基苯肼溶液2 ，4-二硝基苯肼20 m ，溶于10 mol/L HCl 10 ml， 移至l00ml容量瓶内，以蒸馏水稀释至刻度，混匀，贮存于冰箱中待用。 6 ．0.4 mol/L NaOH 。 7 ．丙酮酸标准液 准确称取干燥至恒重的丙酮酸钠11 m ，置于100 ml容 量瓶内，用0.1 mol/L H SO 。使其溶解，并稀释至刻度，混匀，置于 2 4 冰箱内保存待用。此标准液1 ml大约相当于1 µmol/L丙酮酸。 （三）方法 1．绘制标准曲线按表1操作。 表1 标准曲线绘制的操作 置37 ℃水浴15 min后，各管加入0.4 mol/L NaOH 。10 ml，混 匀，室温下放置5 min，以1号为空白，440 nm处比色。以 LDH为横坐标，以各管光密度值为纵坐标，绘成标准曲线。 2 ．细胞培养液中LDH测定见表2 。 表2 细胞培养液中LDH测定 混匀后室温下放置5 min，以对照管为空白，440 nm处比色。 根据标准曲线确定细胞培养液中LDH 的活性。 （四）结果与分析 通过直接比较每培养孔LDH 的活性来判定药物或毒物的细 胞毒性。培养孔LDH