应用RNA干扰技术的研究Neuritin对Neuralized介导Notch信号途径影响.pdf

摘要 目的：观察Neuritin 表达降低对Neuralized 介导的Notch 信号途径的影响，探讨Neuritin 在神经再生及神经系统可塑性中的作用机制。 方法： （1） Neuritin 高表达细胞株的筛选：应用RT-PCR 技术检测293T 细胞及L-02 细胞中 neuritin 基因的表达水平。 （2 ） PBS/U6-neuritin siRNA （1-3）表达载体的构建：应用基因工程的方法以PBS/U6 为空载体，通过两步法构建PBS/U6-neuritin siRNA 干扰质粒。 （3 ） PBS/U6-neuritin siRNA 干扰质粒的鉴定：PBS/U6-neuritin siRNA 干扰质粒转染 Neuritin 高表达细胞株，Western-blot 检测细胞中Neuritin 的表达，鉴定干扰载体 的干扰效率。 （4 ） Neuritin siRNA 对Notch 信号途径配体Jaddeg1 蛋白表达水平的影响：利用脂质 体介导法共转染pIRES-HA-JAG1 与PBS/U6-neuritin siRNA- （1-3）与293T 细胞 中，Western-blot 检测Neuritin 蛋白表达降低时，Jaddeg1 蛋白的表达水平。 （5 ） Neuritin siRNA 对Jaddge1 蛋白内吞的影响：利用细胞内荧光定位技术观察细胞 内Neuritin 蛋白表达降低时，Jaddge1 蛋白的内吞情况。 结果： （1） RT-PCR 结果显示：Neuritin 蛋白在293T 细胞及L-02 细胞中高表达，选择293T 细胞为实验细胞株。 （2 ） 载体构建及干扰效率鉴定结果：PBS/U6-neuritin siRNA1-3 载体经测序鉴定 后,Western-blot 结果显示neuritin 干扰质粒可使293T 细胞内源性Neuritin 表达降 低。 （3 ） Neuritin siRNA 对 Jaddeg1 蛋白表达水平的影响：Western-blot 结果显示，阻断 Neuritin 的表达，细胞中Jaddeg1 蛋白表达水平下调。 （4 ） Neuritin siRNA 对Jaddge1 蛋白内吞的影响：Neuritin 蛋白表达降低引起Jaddeg1 蛋白内吞增加。 结论： （1） Neuritin 蛋白表达降低可以导致Notch 信号途径配体Jaddeg1 蛋白的表达下调。 （2 ） Neuritin 蛋白表达下调可使Jaddeg1 蛋白的内吞增加。 综上所述：Neuritin 是Notch 信号途径配体Jaddeg1 蛋白的负调控因子，可能通 过影响Jaddeg1 蛋白的表达和内吞影响Notch 信号途径。 关键词：Neuritin ，Jaddeg1 ，Notch 信号途径，Neuralized I Abstract Objective: (1) To study the mechanism of Neuritin on neural regeneration and plasticityof neural system, the effect of neuritin on Notch signaling pathway mediated by Neuralized was observed. Methods: (2) Screen of cell lines with high neuritin expression: cell lines with high neuritin expression were screened by RT-PCR. (3) Construction of the siRNA expression plasmids of neuritin: PBS/U6-neurit