第9章 组织培养技术-2012.ppt

组织培养 Tissue Culture 一、组织培养的定义 组织培养： 细胞、组织或器官→离体→合适的培养液、温度、无菌→使之生存和生长 根据培养物的不同，组织培养又可分： 细胞培养、组织培养和器官培养。 二、组织培养的应用 1. 优点： （1）研究对象是活细胞，可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。 （2）研究对象广泛，包括各种组织细胞。 （3）可研究各种理化因素（温度、药物、毒素等）对细胞代谢、增殖、分化的影响。 （4）研究方法多样，如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等，研究结果便于观察记录。 应用： 病毒学：细胞培养是分离培养病毒的重要手段，用于病毒感染的诊断，生产病毒疫苗。 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体技术。 遗传学：从子宫取得胎儿细胞做染色体分析，进行遗传学诊断，试管婴儿等。 肿瘤学：抗肿瘤药物筛选。 二、组织培养的应用 2. 不足之处： 体外与体内培养条件不完全相同，失去神经内分泌系统的调节作用，培养的细胞存在一定的差异，故对结果的判断应慎重。 三、培养细胞的特性 1. 培养细胞的分型（按生长方式分） （1）贴附型： （2）悬浮型： 1. 培养细胞的分型（按生长方式分） （1）贴附型：大部分细胞附着于支持物表面生长，分化不明显，形态单一，常反映其胚层起源。如上皮细胞型，成纤维细胞型，多形细胞型。 （2）悬浮型：不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，细胞呈圆形，单个或细胞团排列；见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞。 三、培养细胞的特性 2. 培养细胞的生长和增殖 原代培养（Primary Culture）：从体内取出组织开始在体外培养，在其传代之前。 传代培养（Subculture）: 将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中，并补充更新培养液。 细胞系（Cell line）：原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。 细胞系的生长过程 细胞系的生长过程 原代培养期：1-4周，与体内细胞相似，但分裂不旺盛，含细胞类型较多。 传代期：持续时间最长，细胞分裂增殖旺盛，保留原组织细胞的很多特征，一般传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢。 衰退期：细胞增殖缓慢，并逐渐停止，细胞形态轮廓增强，最后衰退、死亡。 实验研究的最佳时期： 三、培养细胞的特性 1. 营养需要： 碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素 防止污染 要注意防止微生物（细菌、病毒、真菌、支原体等）的污染、不同细胞类型的交叉污染。 出现以下情况时培养细胞可能有污染： 1) 培养液的酸碱度异常改变，如短期内颜色变黄 ； 2) 培养液出现混浊； 3) 光镜观察到大量颗粒或菌丝； 4) 细胞生长停止或出现死亡。 四、组织培养的常用设备 1. 仪器 包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备，如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微镜、离心机、液氮容器等。 超净工作台 CO2培养箱 四、组织培养的常用设备 2. 器皿 四、组织培养的常用设备 3. 试剂 （1）天然培养基：动物血清（如胎牛血清、小牛血清）。 （2）合成培养基：如RPMI1640、DMEM、199等。 多采用合成培养基+天然培养基（5-20%）。 （3）平衡盐溶液：由无机盐和葡萄糖组成，用于洗涤、配 液、维持渗透压，调节PH值等，如PBS、Hank’s等。 （4）消化液：用于消化解离组织块，使贴壁细胞从附着物 脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。 五、基本培养技术 1. 无菌操作 2. 取材 3. 组织分离 4. 原代培养 5. 传代培养 6. 细胞冻存与复苏 五、基本培养技术 1. 无菌操作： 防止污染是决定组织培养成败的关键，必须无菌操作！ （1）培养前的消毒灭菌 待用物品：洗涤、消毒灭菌。 无菌室：紫外线照射30-50min，新洁尔灭拖地。 超净台：75%酒精擦洗，紫外线灭菌等照射30min。 （2）洗手和着装 彻底洗手，着清洁工作服，酒精消毒手。 （3）无菌培养操作 超净台内操作，点燃酒精灯，火焰附近操作，在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。 不直接用手触及器皿的无菌部分，如瓶口、瓶塞内侧，必要时借助镊子。 吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。 转移液体时，吸管口不能触及瓶口，以防交叉污染。 饭盒、瓶子不要过早打开，使用后及时盖好，瓶塞倒置在桌面。 面向操作台时勿大声讲话、咳嗽，以免喷出唾沫，污染工作台面。 操作完毕，整理台面，酒精擦拭。 五 、基本培养技术 2. 取材