第三章 的生产.ppt

Enzyme Engineering酶工程;第三章 酶的生产制备 ;;生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶。 1949年细菌发酵生产淀粉酶 上个世纪70年代以来利用植物细胞和动物细胞培养技术生产酶。 木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生产血纤维蛋白溶酶原激活剂;动植物细胞培养的特殊性： 1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几千倍， 2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁更甚 3、生长速率比微生物低，生长倍增时间和发酵周期均更长， 4、对营养的要求较微生物复杂，动物细胞往往需要添加血清和其他营养成分;3、酶的发酵生产;第一节 酶的生产菌种;;;二、产酶菌种的要求 （1）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活生物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。 （2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖快，产酶量高，有利于缩短生周期 （3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。 （4）目标酶的产量要高，性能符合应用需要，产生的酶容易分离纯化，最好为胞外酶。 （5）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。; 三. 产酶微生物的分离和筛选 1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品 2)富集培养: 投其所好，取其所抗 3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。 4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。 5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。 ; ?-淀粉酶的筛选 ;蛋白酶产生菌的获得方法;第二节 酶的发酵技术;三、发酵方法 ;第三节 提高酶产量的方法;2、诱导和阻遏 诱导： 诱导物的加入后，酶才大量合成， 参与分解代谢的酶：淀粉酶、纤维素酶 阻遏： 末端代谢物阻遏： 反馈阻遏，合成代谢中的关键酶 分解代谢物阻遏： ; 1. 酶合成的诱导 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； ?-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成； （3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。;调节基因; 2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。; 色氨酸操纵子——酶的阻遏 ;酶的诱导和阻遏操纵子模型;3.分解代谢物阻遏;分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。;分解代谢物阻遏;三、提高酶产量的策略 （一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株 2. 基因工程育种 ;二、提高酶产量的策略 （一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株 2. 基因工程育种 ;（二）.通过条件控制提高酶产量 （1）添加诱导物 选择适宜的诱导物及浓度: 诱导物： 酶的作用底物 酶作用底物的前体 酶的反应产物 酶的底物类似物或底物修饰物等 IPTG/乳糖 纤维素/纤维二糖诱导纤维素酶 ;（2）降低阻遏物浓度 避免使用