探针的纯化.ppt

核酸分子杂交的基本原理 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 Western 印迹法 原位杂交 斑点印迹杂交 液相杂交 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 主要应用 1.遗传病诊断 　　 2.DNA图谱分析 　　 3.PCR产物分析 Western 杂交印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应 In Situ Hybridization 斑点印迹杂交(dot bloting) 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 (4)探针的纯化 1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质 2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针 ②随机引物法(random primed DNA labeling) 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 随机6-12bp单核苷酸引物 变性 一般探针长度在400-600bp之间 ③末端标记法(terminal labeling) 3’末端 5’末端 ④PCR标记法 ⑤光敏标记法 生物素、地高辛等 光敏基团与生物素结合 ⑥化学衍生结合标记法 转氨标记法等 原位杂交(in situ hybridization) * 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。 将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交 保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定 2、杂交过程： （1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备： （2）组织细胞杂交前的预处理 去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落 （3）探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50~300bp ,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察 （4）杂交 杂交液体积小：10~20μl cDNA和RNA探针杂交温度约为50℃ 杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性