蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化.ppt

蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化  0 1 内 容 蛋白质的定向进化 1 定向进化的方法 2 定向进化的筛选 3 蛋白质定向进化的应用前景 4 2 蛋白质的定向进化方法 2 体外随机引发重组 error-prone PCR（易错PCR） DNA shuffling (DNA改组) 3 2 error-prone PCR（易错PCR） 概念：利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行随机诱变的技术称为易错PCR（error-prone PCR）。 原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTP 的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶。使基因在扩增时能随机的创造突变。遗传变化只发生在单一分子内部,故属于无性进化(asexual evolution) 操作手段： （１）降低氯化镁的浓度； （２）是添加氯化锰 （３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者 用核 苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸 关键：选择适当的突变频率 优点：快速、简便、操作方便 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( 800bp） 3 2 error-prone PCR（易错PCR） error-pronePCR 3 2 DNA shuffling (DNA改组)  DNA改组 ( DNA shuffling )又称有性 PCR ，是将一群密切相关的序列 ( 如多种同源而有差异的基因或一组突变基因文库 )在 DNaseI的作用下随机酶切成小片段，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导 PCR延伸，并重新组装成全长的基因。 3 2 DNA shuffling (DNA改组)  3 2 基因家族之间的同源重组Family shuffling  Family shuffling 指用DNA shuffling 技术, 改组进化上相关的一系列基因。 当从自然界中存在的基因家族出发, 利用它们之间的同源序列进行DNA 改组。由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的进化, 并且基因之间存在比较显著的差异, 所以获得的重组基因库充分体现了基因的多样化，又最大限度的排除了那些不需要的突变。 3 2 体外随机引发重组  体外随机引导重组是以单链DNA为模板，配合一套随机引物，产生互补于模板不同位置的短DNA片段库(由于碱基错配，这些短DNA片段也含有少量的点突变)，然后进行类似于DNA shuffling的全长基因装配反应，获得多样性文库。 与DNA shuffling相比，体外随机引发重组具有以下优点： a．用单链DNA为模板，对模板量要求少，大大降低了亲本组分，便利筛选； b．克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底去除DNase I的缺点； c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作； d．随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了小肽的改造。 3 2 体外随机引发重组  3 3 定向进化的筛选  在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件限制突变种类降低突变率缩小突变库的容量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 手段: 高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。（对比以前的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多，试剂少，信号灵敏，自动化程度较高） 蛋白定向进化最核心的部分在于建库的多样性和筛选的高效性。筛选过程首先是将突变基因进行分离并尽可能多地表达成蛋白质 ，其次是将蛋白质的活性通过亲和、催化或报告基因等方式表现为可检测的形式，最后是将符合要求的蛋白质分离出来。 3 3 蛋白质定向进化的筛选  常用的筛选方法： 利用底物显色反应 改变培养条件(如逐步提高培养温度, 或改变培养基 的pH 等) 利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光 高通量筛选(HTS: High Throughout Screening) , 该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛选, 也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选, 酶活性筛选, 细胞活性筛选等。 3 3 利用底物显色方法筛选  颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一个有色化合物。 3 3 改变培养条件进行筛选  根据细胞生长情况筛