激光显微切割.ppt

激光捕获显微切割技术Laser Micro-Dissection (LMD) Definition of LMD 显微镜下用手工或仪器采样的方法从组织切片或细胞涂片上将所要研究的形态或表型相同的细胞从组织三维构造中分离出来，获得纯的细胞群（pure cell population），以备进一步作分子水平的研究。显微切割技术的贡献就是克服了组织的细胞成分非常繁杂这一重大的缺点。 Laser capture microdissection The History of LMD 1965 ，Baxter TJ，肾小管 1990‘s ，紫外激光切割超薄膜上的组织 1996，NIH，红外激光光源，转运膜技术 美国Arcturus 公司：热塑膜 德国PALM 公司：激光脉冲所产生的压力 Advance of LMD ⑴无破坏性，用于粘附目的细胞的热塑膜厚度约为100～200 μm, 能够吸收激光产生的绝大部分能量， ⑵高精确性，激光定位的准确程度可以达到1 μm， 切割直径可以小到2 μm，捕获点范围达到3～5 μm， ⑶高效率，每次激发耗时不超过1秒, ,单张转运膜可以一次捕获上万个细胞； ⑷自动化程度高，全电脑操作 ⑸无污染，使用全封闭操作，能避免外来物质的污染。 Weakness of LMD 用仪器和耗材昂贵；QIAGEN 染色时对后续反应可能有影响； 对涂片的要求比较苛刻等。 Use Of LMD Cancer 肿瘤基因突变检测 肿瘤特异基因表达分析 杂和性丢失检测 微卫星序列不稳定性分析 新基因发现 核酸及蛋白质的定量研究 染色体畸变分析 细胞局部病变病因学 Pathology and Forensic 组织切片 冰冻切片检验。 法医学中的各种细胞涂片,目前常见的法医物证检材如液体类(精液、血液、唾液、精阴混和液)、斑迹类(精斑,血斑,唾液斑,混和斑等)等 Note the use of LCM DNA 分析基因组DNA 时, 细胞越大, 则需要切割更多的细胞, 才能保证包含细胞的全部基因组 保持基因组的相对完整性, 避免在样品处理过程中造成DNA 的降解和断裂 RNA 建议样本使用冰冻组织块, 同时用Trizol 法抽提原始组织样本RNA,鉴定样本降解情况,确保样本质量。 常规HE 染色,伊红和苏木精配好后用DEPC Protein 可以根据需要制备总蛋白, 或膜蛋白, 或核蛋白等, 也可以富集糖蛋白 通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。 Introduction of Leica LMD6000 紫外激光 UV Laser 热塑膜：保证生物大分子不受损害 自动辨别样品 Work fashion of Leica LMD6000 重力掉落方式, 掉落到指定的 PCR ( RT-PCR ) 盖子上 组织：石蜡切片/冰冻切片/活细胞 LMD 专用 SmartCut UVI-镜头: 6.3x, 10x, 20x, 40x, 63x, 100x. 150x Specimen placement of LMD6000 载片台上有三个平行载片夹 切割时视野只在单一玻片内 Collection tube A/B/C/D四个收集孔，管盖固定在收集孔上 Focus Mode 电动控制焦距调节 步幅小 稳定 Special Glass slide 含热塑膜 特制玻片，成本约40元/片 Cutting of paraffin section 石蜡包埋 HE染色 Multiple cutting of brain section 连续切割 容易出现切割不下来，需要手动辅助 Living cell cutting of LMD6000 荧光显微镜下切割活细胞 Annotation:How to prepare frozen section 1. 取 材：取新鲜的组织。 2. 固 定：组织固定于10%中性福尔马林,冰冻切片。 3. 切 片： 利用切片机的厚度调节旋钮调节切片厚度，调整切片角度，安装切片刀。 将样品放到样品托上，利用包埋剂固定，放到冷台上冷冻，在即将完成冷透前用热交换装置压平。 将样品放到样品头上，用样品快进按钮将样品移近刀口，利用慢进按钮开始修片，修好后即可放下防卷板切片，使切出的样品进入防卷板与刀片的狭缝，取出后染色观察