力达霉素产生菌球孢链霉菌C1027中atrA同源基因的克隆及.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（８）：５２５９ 力达霉素产生菌球孢链霉菌Ｃ１０２７中ａｔｒＡ 同源基因的克隆及分析    李光伟 　王丽非 　王松梅　洪　斌 （北京协和医学院中国医学科学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室　北京　１０００５０） 摘要　目的：在天蓝色链霉菌ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＡ３（２）中多效性调节因子ＡｔｒＡ（ＡｔｒＡｃ）可通过激 活放线紫红素途径特异性的调节因子ＡｃｔＩＩＯＲＦ４的转录来控制放线紫红素的产生。在灰色链霉菌 ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓＮＢＲＣ１３３５０和阿维链霉菌ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓＭＡ４６８０中也发现了ＡｔｒＡｃ编 码基因（ａｔｒＡｃ）的同源基因，分别影响链霉素和阿维菌素的生物合成。为探索球孢链霉菌Ｃ１０２７ （ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓＣ１０２７）中是否存在ＡｔｒＡ，克隆球孢链霉菌Ｃ１０２７中ａｔｒＡ基因并进行生物 信息学分析，为进一步确定其对力达霉素产生的调控作用及调控机制奠定基础。方法：采用在球孢 链霉菌Ｃ１０２７中异源表达ＡｔｒＡｃ，来确定ＡｔｒＡｃ对力达霉素产量的影响；通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析来 判断在球孢链霉菌Ｃ１０２７基因组中是否有ａｔｒＡｃ同源基因；ＰＣＲ扩增方法获得球孢链霉菌Ｃ１０２７ ａｔｒＡ基因（ａｔｒＡｇｌ）并测序；通过多种生物信息学软件来分析ａｔｒＡｇｌ及其与旁侧基因的组织结构、对 已发现的ＡｔｒＡ蛋白进行同源性比对及亲缘关系分析。结果：在球孢链霉菌Ｃ１０２７中异源表达天蓝 色链霉菌ＡｔｒＡｃ蛋白，发现其对力达霉素的产量有影响。以ａｔｒＡｃ为探针，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析 显示球孢链霉菌Ｃ１０２７基因组中存在ａｔｒＡｃ的同源基因。ＰＣＲ扩增得到球孢链霉菌Ｃ１０２７的ａｔｒＡ 基因的全序列以及该基因上下游的旁侧序列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ登录号ＧＵ７２３７０７）。通过对球 孢链霉菌Ｃ１０２７、天蓝色链霉菌Ａ３（２）、灰色链霉菌ＮＢＲＣ１３３５０以及阿维链霉菌ＭＡ４６８０ＡｔｒＡ蛋 白序列进行同源性分析发现，４种ＡｔｒＡ蛋白编码氨基酸序列一致性达到６５％～８７％，相似性高达 ７０％～８９％。并且，球孢链霉菌Ｃ１０２７ａｔｒＡ基因与相邻基因形成的组织结构与天蓝色链霉菌和灰 色链霉菌完全一致。根据蛋白质同源性绘制进化树，发现球孢链霉菌ＡｔｒＡ蛋白与灰色链霉菌ＡｔｒＡ 蛋白亲缘关系最近。结论：确定在球孢链霉菌Ｃ１０２７中存在ａｔｒＡ同源基因并影响力达霉素的产量， 克隆了首个力达霉素生物合成基因簇外的调节基因———ａｔｒＡ基因，通过生物信息学分析初步推测了 该基因的功能，为进一步研究ＡｔｒＡｇｌ对力达霉素途径特异性级联调控网络的调控关系奠定了基础。 关键词　球孢链霉菌Ｃ１０２７　ａｔｒＡ调控基因　力达霉素 中图分类号　Ｑ７８５ 　　链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）是土壤中具有复杂生活周期 多种抗生素，在医疗、农业、食品等领域中广泛使用。 的革兰氏阳性放线菌，能产生多种次级代谢产物包括 链霉菌的次级代谢产物的产生与复杂的分化密切相 关，其生物合成基因往往成簇排列，其中包含一个或多 收稿日期：２０１００４２３　　修回日期：２０１００５２６ 个途径特异性的调控基因，例如天蓝色链霉菌中调控  国家“十一五”计划 “重大新药创制”科技重大专项 ［１］ （２００９ＺＸ０９５０１００８）、国家自然科学基金３０５７２２７４）、国 放线紫红素产生的ａｃｔＩＩＯＲＦ４基因 。多效性调节基 家“８６３”计划（２００６ＡＡ０２Ｚ２２３）、教育部新世纪优秀人才