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Construction and functional verification of TALEN vector for FGF5 gene editing in sheep A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By LiangLong LiangLong LLiiaannggLLoonngg (((Animal Genetics，Breeding and Reproduction))( )) Dissertation Supervisor: Researcher Pi Wen-hui June, 2013 编辑绵羊FGF5 基因的TALEN 质粒构建及功能验证 摘要 转录激活因子样效应子（Transcription Activator-Like Effectors, TALEs）是植物致病 菌黄单胞杆菌（Xanthomonas）通过III 型分泌系统注入到宿主细胞内的一类蛋白效应子， 能够与DNA 实现特异性的结合。TALE-DNA 结合结构域由串联重复模块单元组成，大 部分重复单元含34（33～35）个氨基酸，单元的第12 和13 位氨基酸高度可变，称为重 复可变区（repeat variable diresidues, RVDs）。TALE 的RVDs 识别DNA 序列的4 个碱基 TALE 13 DNA 具有高度的专一性， 重复单元的第 位氨基酸直接与 的碱基特异结合。根 据简单的分子密码重新排列重复模块，能够靶向新的DNA 序列。研究者几乎能够针对 任何DNA 靶序列，构建特异性TALE-DNA 结合域。人工构建的TALEs 已经成为有效 的基因组编辑和转录调控工具。 几乎一致的重复单元序列，利于TALEs 实现模块化、工程化构建。目前有多套构 建TALEs 的试剂盒，如Golden Gate TALEN Kit、TALEN Engineering Reagents 和TALE Toolbox。这些TALEs 构建试剂盒，大多数结合 “Golden Gate”克隆法，来实现TALEs 的高效构建。 “Golden Gate”克隆法，是目前在TALE 组装中常用的一种方法，该方法充分利用 IIS 型核酸内切酶DNA 结合位点和切割位点不在同一位置，使得切割后的粘性末端具有 多样性。通过人为的设计使得不同的片段在经过同一个酶切后产生差异化的粘性末端， 不同片段间只有按照一定的顺序才能连接起来。由于组装的目的DNA 序列中，不含IIs 型限制性内切酶的识别位点，故不能被同种IIs 型限制性内切酶再次切开。 一、采用TALE Toolbox 试剂盒，运用PCR 扩增结合“Golden Gate”克隆法的实验 方案，人工构建了绵羊FGF5基因位点TALENs。结果表明，该构建策略是一种快速高 效构建TALEs 的方法，能够在1 周内完成TALEs 构建。 二、为了检测人工构建绵羊FGF5基因位点TALEN 的活性，采用Lonza 电转仪，将 绵羊FGF5 基因位点TALEN 质粒电转染进入绵羊成纤维细胞，并用Surveyor 试剂盒检 测其活性。结果表明，针对绵羊FGF5 基因位点人工构建的TALEN 质粒，能够实现对 绵羊基因组FGF5 基因位点的编辑。 三、为了编辑小鼠β酪蛋白基因位点，利用“Golden