吖啶橙二聚体作为荧光探针测定牛血清白蛋白.pdfVIP

第24卷，第6期 光 谱 实 验 室 Vo1．2 4。No．6 2 0 0 7年 1 1月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory November，2007 吖啶橙二聚体作为荧光探针测定牛血清白蛋白① 李芳② 孙向英 (华侨大学材料科学与工程学院 福建省泉州市丰泽区城华北路269号 362021) 摘 要 以吖啶橙在十二烷基硫酸钠介质中生成的二聚体作为荧光探针，讨论了其与牛血清白蛋白 相互作用的情况。实验表明，蛋白质的加入可使低荧光的吖啶橙二聚体荧光恢复．且其荧光增强的程度与 体系中蛋白质的加入量在一定浓度范围内呈线性关系。在优化实验条件下，线性范围为0．8—34 mg／L，检 出限为0．126mg／L。 关键词 牛血清白蛋白，吖啶橙二聚体，荧光分析。 中图分类号：0657．32 文献标识码：B 文章编号：1004—8138(2007)06-1033—04 1 前言 二聚体荧光染料可对体系微环境等因素的变化做出响应，在核酸和蛋白质的定量测定和构象 分析方面的应用日益广泛 卜 。吖啶橙是一种三环芳香类阳离子型的碱性荧光染料，常用于细胞内 DNA与RNA的定量测定及活细胞的染色 ]，在阴离子表面活性剂影响下，可引起其自聚平衡的 改变 ，使体系荧光强度降低，加入蛋白质后体系荧光强度显著回升，且与体系中蛋白质的加入量 有良好的线性关系，因此可作为蛋白质测定的一种新的方法。 2 实验部分 2．1 主要仪器与试剂 荧光分光光度计Cary Eclipse(美国Varian公司)；紫外可见光谱仪UV-2401C(日本Shimadzu 公司)；酸度计MODEI 828(美国奥立龙公司)；Milli—Q基础型(美国Millipore公司)纯水系统； 牛血清白蛋白(BSA，华美生物工程公司)：用二次水配成100．0mg／I 储备液，置于1—4 C保存 备用； 吖啶橙(AO，上海化学试剂公司)：配成1．0×10_。mol／I 储备液，使用时逐级稀释； 十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液(广东汕头西陇化工厂)； Tris—HCI缓冲液：0．05mol／I pH=7．4； 所用试剂均为分析纯，实验所用水为Milli—Q纯水系统提供的二次水。 2．2 实验步骤 在一系列lOmI 比色管中分别依次加入2mI 0．05mol／I pH=7．4的Tris—HCI缓冲液、0．6mI 1．0×10_“mol／I 的AO溶液、1．2mI 5．0×10_。mol／I 的SDS溶液，0．8—34mg／I 的BSA标准溶 ①基金项目 福建省自然科学基金(D0410019和D0710017)；国务院侨务办公室科研基金(06QZR10)。 ②联系人．手机：(OE—mail；lifangqz@hqu．edu．cn 作者简介：李芳(1973一)，女，福建省泉州市人，讲师，硕士，主要从事分子光谱方面的研究． 收稿日期：2007—08—20t接受日期：2007—08·27 光谱实验室 第24卷 液，摇匀，用二次水定容，放置20min后，以498nm为激发波长，在发射波长为533nm处测量其荧 光强度F，同时在相同条件下测其试剂空白Fo，由△F—F—Fo对BSA的浓度做校准曲线。实验采 用lcm的石英比色皿，激发狭缝及发射狭缝皆为5nm。 3 结果与讨论 3．1 蛋白质对体系吸收光谱的影响 吖啶橙染料在阴离子表面活性剂SDS溶液中存在单体和二聚体的转化，当SDS浓度接近“预 胶束”的生成浓度时，由于表面活性剂分子自相接触，憎水基靠拢形成胶束前的预聚集，水分子在表 面活性剂分子或胶束预聚集分子周围形成有序的区域，即所谓“冰山结构”，导致溶剂的性质向着有 利于AO二聚体形成的方向变化 ]。在吖啶橙二聚体形成的适宜表面活性剂浓度中，加入适量牛血 清白蛋白，由其吸收光谱(图1)可以发现，AO的最大吸收峰位于495nm，加入SDS后，吸收峰蓝移 至469nm；在A0+SDS体系中加入BSA后，与AO+SDS体系