实时荧光pcr检测玉米细菌性枯萎病菌（pantoea+stewartii+subspstewartii）的研究.pdfVIP

实时荧光PCR检测玉米细菌性枯萎病菌 ([)cllT[OCd。Y≠洲dl?ttiisu bsp。f蹦埘，iii)的研究 中文摘要 玉米细菌性枯萎病是玉米上的一种毁灭性的病害；尤其对甜玉米更甚，在严重情 况下可造成颗粒无收。目前我国尚无正式分布的报道，是被我国列为禁止进境一类检 疫性有害生物。在我国口岸的检疫中，一直沿用传统的分离培养、生理生化鉴定、噬 菌体检测、免疫荧光染色和致病性试验等检验的方法。应用该类方法耗时长、效率和 灵敏度均较低，且经验性很强，又往往难以确定准确的细菌种类，不适合口岸快速验 放的要求，难以标准化和大规模的推广应用，这些也J下是目前细菌病原缺乏标准检测 方法的重要原因。建立快速、准确的检测方法迫在眉睫、意义重大。 本研究成功建立了玉米细菌性枯萎病菌检测的TaqMan探针实时荧光PCR检测 方法，且在国内外未见相同方法报道。将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测 序，根据本细菌与其它细菌菌株16S rDNA序列差异，设计出对玉米细菌性枯萎病菌 具有稳定点突变的特异性探针，除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外，还对假单胞菌 属1个种，黄单胞菌属1个种，棒形杆菌属1个种，短d,gNN 1个种以及5种植原 体进行了实时荧光PCR。结果表明，只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光，其他细菌和 植原体都没有荧光产生。且绝对灵敏度比凝胶电泳高100倍，达到2．53×106个阳性分 子。检测的灵敏度为104CFU／mL的菌悬浮液，相当于4个细菌细胞的基因，灵敏度高， 也就是说，反应体系CRag有2个活细菌，实时荧光PCR就能检测到。相对灵敏度为 7 10CFU／mL，而且整个检测过程只需2小时，由于实验采用独特全封闭反应管及光电 传导系统，不用凝胶电泳，降低了污染。 本方法特异性强、灵敏度高、可以快速、直接检测到玉米细菌性枯萎病菌，在检 验检疫工作中有广阔的应用前景。 关键词：TaqMan探针，实时荧光PCR，玉米细菌性枯萎病菌，检测，鉴定 ofPantoeastewartii andidentification Detection subsp PCR Fluorescent 5，gⅥ，artiiReal．time by BYYANXIANG QI Abstract Pantoeastewartiistewartiiisa bacteriumontheA1 subsp veryimportantquarantine listof hasnotbeen inChina traditional for China，which reported yet．The methods detectionPantoeastewartiistewartiiwere and of subsp isolating and test．These are biochemical ser