抗原致敏树突状细胞诱导杀伤k562细胞体外实验研究.pdfVIP

增培养D(、。 2．从形念、免疫表型、混合淋巴细胞反应等方面进行Dc的鉴定。 3．研究Dc在体外负载K562细胞冻融抗原后能否刺激诱导产，卜(”l l，，观察抗 原激活的Dc诱导c rL对靶细胞K562的特异性杀伤作用。 材料和方法 1材料 CDl4等流式细胞荧光标记抗体；淋巴细胞分离液。 健康志愿者外周血；K562细胞株；前列腺癌PC3细胞株。 2方法 2．1细胞培养 2．1．1DC的诱导培养 无菌抗凝采集健康人外周血，淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，以2～ 5×106／ml浓度，在5％cO：饱和湿度、37。C条件下孵育2小时，获得贴壁的细胞， 50ng／ml，第 量换液，同等量添加上述细胞因子，在第7天起每天添加TNF—q 10天收获细胞。 2．1．2 K562细胞的培养 件下常规培养。每2-3天换液，细胞铺满瓶底时传代。 2．1．3前列腺癌PC3细胞培养 用含IO％FCS的RPMI一1640培养液培养，细胞铺满瓶底时用胰酶消化传代。 2．1．4淋巴细胞培养 XlOe／ml，加入含 取健康人PBMC孵育2小时后取非贴壁细胞，调细胞浓度1 IL_2 lOOU／ml的PRMI-1640培养液中培养。 2．2 Dc的鉴定 2．2．1形态学观察 倒置显微镜下每天观察细胞形态，培养第10天的Dc瑞氏染色摄片，并用扫 描电镜和透视电镜观察及摄片。 H 2 2 2流式细胞仪测Dc免疫表掣：n。I)c培养的第l《J天，收集细胞，分别 加入鼠抗人CDla，CD80，CD83，CD86，(、f)】1单抗，流式细胞仪检测。 2．2．：{ 同种异体混合淋巴细胞反』、i 反应细胞制各：复苏冻存的异体外周血非贴壁细胞，调细胞浓度2×106／ml。 刺激细胞制备：取培养第10天的叱悬液，以丝裂霉素去增殖作用后为实验 组。以同供者的PBMC经丝裂霉素同样处理后为对照组。 MTT法测淋巴细胞增殖活性：刺激细胞与反应细胞比例分别为1：10，l：50， 的光密度(OD)值。 2．3致敏DC诱导的CTL对K562细胞特异性杀伤作用 2．3．1K562细胞冻融抗原及PC3细胞冻融抗原的制备 取细胞浓度为1X107／ml细胞液，反复冻融，高速离心，取上清，0．221．tm 滤膜滤过除菌。 2．3．2DC负载冻融抗原 K562冻融抗原，对照组 实验组在DC培养的第6天每毫升培养体系加100p1 4小时，PBS PC3冻融抗原。作用2 在DC培养的第6天每毫升培养体系加lOOpl 洗涤。 2．3．3测定培养的淋巴细胞中CD3、CD4、CD8阳性细胞数 收集培养的淋巴细胞，涂3孔，SABc法测定，AEC显色，计数100个单个核 细胞中阳性细胞数。 2．3．4LDH释放法测细胞毒作用 CTL培养方法：培养第10天负载抗原后的Dc与自体淋巴细胞浓度比为1／20， 等液体量混合，加IL一2 量换液并添加IL一225U／ml，诱导出的细胞即为CTL。以同样方法培养未经抗原 四组： 胞培养。 对照组A(未致敏Dc组)：未致敏Dc为对照，未以抗原负载，培养第10天 Ⅱl DC加自体淋巴细胞后一起培养。 对照组B(淋巴细胞对照组)：单纯门体淋巴细胞，末以DC激活。 对照组C(PC3对照组)：第l()天负载胁列腺癌细胞冻融抗原的Dc加自体淋 巴细胞一起培养。 以乳酸