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2017 酶促反应动力学实验 ——16级临床16班黄灏20160202331607 1 实验目的及原理 2 实验方案设计 3 实验注意事项 目录 01 实验目的及原理 实验目的及原理 实验目的：酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素。影响酶促反应的因素主要包括酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂。本实验主要讨论温度对酶活性的影响、抑制剂对酶活性的影响。掌握酶的最适温度的概念 ;掌握温度对酶活性的影响；掌握酶的抑制剂种类、概念；掌握酶的竞争性抑制剂的动力学特点。 实验原理：酶作为生物催化剂与一般催化剂一样呈现温度效应，酶促反应开始时，反应速度随温度升高而增快，达到最大反应速度时的温度称为某种酶的最适温度。由于绝大多数酶是有活性的蛋白质，当达到最适温度后，继续升高温度，引起蛋白质变性，酶促反应速度反而逐步下降，以至完全停止。 酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间长短有关。测定酶活性均在酶促反应最适温度下进行。常用恒温水浴保持温度恒定。大多数动物来源的酶最适温度为37~40℃。 本设计性实验以人唾液淀粉酶为例，观察高温（沸水浴）、最适温度 （37℃水浴）和低温（冰水浴）环境对酶活性的影响，并根据底物即淀粉水解的快慢来判断酶活性的高低。 淀粉经淀粉酶催化水解为葡萄糖的不同阶段，与碘试剂作用的颜色反应如下：淀粉（蓝色)→紫色糊精（紫色)→红色糊精（红色)→无色糊精（不显色)→麦芽糖（不显色)→葡萄糖（不显色)。 抑制剂对酶活性的影响 能降低酶活性，甚至使酶活性完全丧失活性的物质，被称为酶的抑制剂。酶的抑制分为可逆性抑制与不可逆性抑制。不可逆性抑制剂与酶生成共价结合的复合物，或以其他结合方式生成结合牢固且难以再解离的复合物。可逆性抑制剂多为与酶的底物化学结构相似的物质，可与酶的活性中心结合，从而使酶与其底物结合的比例减少，降低酶促反应速率，但当加大底物浓度时，可逆转其抑制。 本设计实验以琥珀酸脱氢酶为例，观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。在隔绝空气的条件下，从加入的甲烯蓝的褪色情况来判断琥珀酸脱氢酶的活性 02 实验步骤设计 实验步骤设计 温度对酶活性的影响 1. 试剂 ⑴ 1/15 mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS)：称取NaH2PO4·2H2O10.4 g，溶于1000 mL蒸馏水中，即为1/15 mol/L NaH2PO4液。称取Na2HPO4·12H2O 23.88 g，溶于1000　mL蒸馏水中，即为1/15 mol/L Na2HPO4液。 取1/15 mol/LNaH2PO4液51 mL，加1/15 mol/L Na2HPO4液49 mL，混匀，即为1/15 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液。 ⑵ 1%淀粉液。 ⑶ 0.3%稀碘液：溶解2 g KI于20 mL蒸馏水中，加入1g碘，于量筒中稀释到300 mL。 ⑷ 0.9%NaCl。 2. 器材 ⑴ 试管及试管架。⑵ 滴管。⑶ 刻度吸量管。⑷ 恒温水浴、冰水浴、沸水浴。⑸ 白瓷比色盘。 1.收集唾液淀粉酶 2.取三支试管，分别编号为A，B，C。向三只试管中加入4mL磷酸缓冲液，2mL0.9%NaCl，然后再向三支试管中加入2mL淀粉液。 3.将A，B，C三支试管分别装入100℃，37℃，0℃恒温水浴箱中恒温水浴5min,使每支试管保持恒温后再分别向每支试管中加入2mL人唾液淀粉酶，再恒温水浴5min。 4.将A，B，C试管中的试剂滴一滴在白瓷比色盘上，然后分别向三个盘里滴加2～3滴稀碘液 5.比色，得出实验结果，并小组讨论出实验结论 实验步骤 【注意事项】 1.严格控制水浴时间 试管 1/15mol/L磷酸缓冲液（ml 0.9%NaCl（ml） 1%淀粉液（ml） 人淀粉唾液酶（ml） 温度（℃ A 4 2 2 2 100 B 4 2 2 2 37 C 4 2 2 2 0 抑制剂对酶活性的影响 【实验试剂和器材】 1. 试剂 ⑴ 1/15 mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液：称取9.078 g KH2PO4溶于蒸馏水中，1000 mL容量瓶中稀释到刻度，为1/15 mol/L KH2PO4溶液。称取23.87 g Na2HPO4·12H2O溶于蒸馏水中，于1000 mL容量瓶中稀释到刻度，为1/15 mol/L Na2HPO4溶液。 取1/15 mol/L KH2PO4溶液175 mL，1/15 mol/L Na2HPO4溶液825 mL，混合，即为1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液。 ⑵ 琥珀酸。⑶ 0.02mol/L琥珀酸。⑷ 0.2mol/L丙二酸。⑸ 0.02mol/L丙二酸。⑹ 0.02%甲烯蓝 2. 器材