猪肺炎支原体p97基因r1区原核表达产物单克隆抗体的制备与鉴定.pdfVIP

猪肺炎支原体P97基因R1区原核表达产物 单克隆抗体的制备与鉴定 摘要 纤毛黏附因子lxY7是猪肺炎螈体的特异蟮夕卜朋∈蛋白，该蛋白C端的R1区是 其主要的抗原决定簇。本研究将舍有猪肺炎支原体黏附因子P97基因抗原决定簇R1 区的重组大肠杆菌，经IFIG诱导表达，得到—分子量约29kD的融合蛋白。该重组 茵经超声裂解，SDS分析表日月’重妇蛋白主要以可溶形式存在于上清液中。 显示为单—蛋白条带，参电化敲果较好．纯北。产物经w融脚lb娃检测证实具有较强的 免癌反应性以此纯嘲重组蛋白为免疣碌，腹髓主射竞I癌8周龄BAI．剧C小鼠， 100Hg，只，加强爱I；唳三天后，取免癜j、鼠睥细目蚜睛髓瘤细胞sP2m进行融合．分 别以纯化的重组蛋白殁来重细菌体蛋白为包披抗曛，用间接班飓A平行筛选阳性充 隆，经有限稀释法3次亚克隆后，获得两株能稳定分泌特异性掖体的杂交瘤细胞株， 分别命名为A9H7和HllE7。单允隆抗终的特性鉴突结果为：两样单抗的免癌球蛋 试验中，两椿单抗均与黼炎支原体反应，而与猪彝轰原体(1Vih)、赭僚状支原体 (Mf)和鸡毒支原体(Mg)无变曳反应，表明两株单抗为针对猪肺炎支原体的特 畀】生．日屿t．．进一步嗬该萆蝴于卑抗阻断ELISA中，植懒{了36份血清样，其申15 份呈阳性，检测结果与mDⅨ公司猪肺炎支原体扳4№测试荆盒的结果基夺吻合。 从而为猪肺炎支原体诊断试剂盒的研制及猪气喘病早期诊断方法的建立奠定了基 础。 关键词猪肺炎支原体P97基因重组蛋白 单克隆抗体ELISA -l- 文献综述 支原体(Myco帅，亦称霉形体)在分类E介于细菌和病毒之间的—类微生 物，最早由Nocard和Roux(1898)从牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)病例中分离到， 初称类胸膜肺炎微生物(PPLOs)。猪肺炎支原体(jl舡砰妇瑚蛳聊识硎帆妇Mhp) 它部位还分离到猪鼻支原体(埘明撕咖泔帅出蛐1)、猪絮状支{群(^批印妇糊 ／／蚴utare Mr)、猪腹支原体(明蛔驴妇阡鲫蹦矾d)、脲原体(狮踟砒踟驾尿原体) 及多种无胆甾原体“cJ|础础研脚)f“目，但这些支原体并不普遍，致病意义也较小。 M岫的分类雌啦：植物界一原生植物门——暂皤诈嘲}—-支原体日——支原体科 ——支原体蕾——稍肺炎支原体。猪肺炎支原体殃乏_般细菌的细胞壁，因而菌体 呈多形性，高倍显微镜下可见群索状、环状、杆状、丝状及点状的菌体形态。营养 条件要求苛刻，对青霉素和磺胺类药物均不敏感．对乙酸铊有很强的耐受瞪“JJ。 1．猪肺炎支原体的致病机理 众所周知，猪呼吸道本身有三道防线来阳I汐嘲蹋墩细病菌的侵入。第—道防 线鼻腔，过滤阳IE空气中灰尘颗粒和湿润空气；第二道防线支气管纤毛，黏附清除 病菌：第三道舫线肺部巨噬细胞和免疫调理素，清除病毒。由于气源性感染主要是 各种细菌，故呼吸道三蝴中，第二道防线最为重要。支原体的致病就是破坏了 第二道防线——支气管纤毛。 通常呼吸通缉毛的功能有两个：一是机械性过滤空气，能黏附呼吸道中的各种 病原菌和细小灰尘颗粒，阻IE其进入呼吸道及肺部；二是通过纤毛的规律性摆动清 除呼吸道中的异物(包括肺泡分泌液，空气源性的微细粉尘和各种病原菌)，保证 呼吸道的干挣无菌。当M吣感染时，支原体黏附于猪呼吸道枯膜上皮细胞的纤毛上， 并大量增殖，导致纤毛变短、交少、甚至大面积脱落，呼吸系统防御能力下降，气 源性病菌长驱直入，极易引起呼吸道感染。116-橱谔I起咳喘，同时不断向环蒯非出病 原，引起大群猪发生气喘病。多种病原混合感染的情况更为严重，难以治愈pw。 Mebus安即用扫描电子显微镜观察被Mhp感染的气管及支气管组织表面形态结 构的变化，发现病猪的气管及支气管上出现大量猪肺炎支原体细胞，t皮细胞明显 一2． 减少。T萄i腿舻(1982)m超薄切片技术，观察到蛐驴感染的病猁赢揪中存在 有荚膜结构的猪肺炎支原体，荚膜厚度为2∞m，并目发现荚膜使支j承体黏附于纤 毛表面，造成纤毛大量脱落，在M吣与宿主的相互作用过程中起重要作用。国内， 黄芬网用电子显微锣减察Mhp的超徽结构，发现了荚膜的存在。大量}研究已I证明， 黏附碥主细胞的表面是吏原体致病的关键。所以很可胄锥纤毛的表面存在着支原 体特异受体，某