人端粒酶催化亚单位（htert）反义寡核苷酸对子宫内膜癌ishikawa细胞生存能力影响.pdfVIP

中文摘要 ishikawa细胞，观察其对细胞的生长抑制作用及其机理，探 讨子宫内膜癌基因治疗的新方法。 方法：1寡核苷酸的设计合成 根据”ERT基因 ’ mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子区的反义片 ：． 4个碱基，共 段，选择起始密码子上游6个碱基及后续的l 一+20个碱基长度为作用的靶序列的反义寡核苷酸+(ASODN) 另外合成一段hTERT基因的正义寡核苷酸(SODN)作为 对照，每一条链均进行全硫代修饰。‘2ishikawa细胞系购于 北大人民医院妇产科学。采用含1O％新生牛血清(56℃灭活 640 oOu／ml青霉素、1OOu／m1链霉素的I冲MI．1 30min灭活)、1 培养基，在37℃、5％C02饱和湿度条件下培养，实验选用 ‘对数生长期细胞设反义组、正义组、空白对照组。3细胞增 殖抑制实验采用MTT法测细胞增殖抑制情况。4形态学 观察 倒置相差显微镜和Giemusa染色法从形态学上观察凋 Ladder 亡的情况。5测定DNA 提取细胞DNA，用1．5％琼 脂糖凝胶电泳进一步检测发生凋亡的特征性DNA降解。6 流式细胞术分析采用流式细胞仪定量分析经不同浓度作用 的内膜癌细胞凋亡率及细胞周期特异性和蛋白Bcl—2的表达 情况。 结果：1采用MTT法测定细胞增殖抑制率，描绘生长 柱状图(Fig．1)可知不同浓度反义核苷酸与内膜癌细胞共同 孵育后，细胞生长受到抑制，这一抑制作用随浓度的升高及 作用时间的延长而加强。正义核苷酸对内膜癌细胞则无作 用。2细胞形态学变化 倒置相差显微镜观察，正义组细胞 及空白组细胞生长良好，贴壁生长，细胞间结构紧密，轮廓 中文摘要中父捅要 清楚，细胞呈梭型，胞浆内颗粒较少，细胞核隐约可见，细 胞生长旺盛。而反义组细胞有部分变圆浮起，细胞接触变松， 细胞界限模糊，细胞颗粒较多，漂浮细胞数量增加，增殖减 慢。经Giemusa染色后显微镜下见正义组与空白组细胞形态 饱满，细胞核染色均匀，核仁清晰可见；而反义组细胞中出 现细胞质浓缩，变圆，核染色不均匀，核物质边聚成新月形 或块状，未见大量的凋亡小体。说明反义组细胞出现了凋亡 DNA 的形态学改变。3 Ladder测定提取反义组、正义组、 空白组细胞，经1．5％琼脂糖凝胶电泳显示反义组细胞DNA 出现凋亡的特征性改变，即DNA呈梯度样降解并随作用时 间的延长，梯度样条带逐渐明显。而正义组与空白组细DNA 未出现凋亡的特征性改变。4细胞凋亡率 流式细胞仪检测 表明．2．5—1 2．46％， Oumol／L反义组细胞凋亡率分别为：1 18．24％，26．65％，正义组和空白组分别为：5．45％，6．44％， 6．03％，6．98％，随着反义组细胞随浓度增加，凋亡率增加。 5)。不 反义组与正义组和空白组相比较，差异明显(PO．O 同反义组之间相比有显著差异(PO．O1)。而正义组与空白组 比较，无统计学意义(PO．05)。进一步证实了反义核苷酸诱 导子宫内膜癌细胞凋亡。5细胞周期与增殖指数变化细胞 期细胞百分率分别为：55．1O％，61．O1％，72．27％，46．OO％， 48．40％，43．77％，45．10％，S期和G2～M期细胞百分率 为：44．90％，38．99％，27．73％，54．OO％，51．60％，56．23％， 54．90％．反义组细胞