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人端粒酶催化亚单位(htert)反义寡核苷酸对子宫内膜癌ishikawa细胞生存能力影响毕业论文
中文摘要
ishikawa细胞,观察其对细胞的生长抑制作用及其机理,探
讨子宫内膜癌基因治疗的新方法。
方法:1寡核苷酸的设计合成 根据”ERT基因
’ mRNA的序列分析,设计出互补于起始密码子区的反义片
:. 4个碱基,共
段,选择起始密码子上游6个碱基及后续的l
一+20个碱基长度为作用的靶序列的反义寡核苷酸+(ASODN)
另外合成一段hTERT基因的正义寡核苷酸(SODN)作为
对照,每一条链均进行全硫代修饰。‘2ishikawa细胞系购于
北大人民医院妇产科学。采用含1O%新生牛血清(56℃灭活
640
oOu/ml青霉素、1OOu/m1链霉素的I冲MI.1
30min灭活)、1
培养基,在37℃、5%C02饱和湿度条件下培养,实验选用
‘对数生长期细胞设反义组、正义组、空白对照组。3细胞增
殖抑制实验采用MTT法测细胞增殖抑制情况。4形态学
观察 倒置相差显微镜和Giemusa染色法从形态学上观察凋
Ladder
亡的情况。5测定DNA 提取细胞DNA,用1.5%琼
脂糖凝胶电泳进一步检测发生凋亡的特征性DNA降解。6
流式细胞术分析采用流式细胞仪定量分析经不同浓度作用
的内膜癌细胞凋亡率及细胞周期特异性和蛋白Bcl—2的表达
情况。
结果:1采用MTT法测定细胞增殖抑制率,描绘生长
柱状图(Fig.1)可知不同浓度反义核苷酸与内膜癌细胞共同
孵育后,细胞生长受到抑制,这一抑制作用随浓度的升高及
作用时间的延长而加强。正义核苷酸对内膜癌细胞则无作
用。2细胞形态学变化 倒置相差显微镜观察,正义组细胞
及空白组细胞生长良好,贴壁生长,细胞间结构紧密,轮廓
中文摘要中父捅要
清楚,细胞呈梭型,胞浆内颗粒较少,细胞核隐约可见,细
胞生长旺盛。而反义组细胞有部分变圆浮起,细胞接触变松,
细胞界限模糊,细胞颗粒较多,漂浮细胞数量增加,增殖减
慢。经Giemusa染色后显微镜下见正义组与空白组细胞形态
饱满,细胞核染色均匀,核仁清晰可见;而反义组细胞中出
现细胞质浓缩,变圆,核染色不均匀,核物质边聚成新月形
或块状,未见大量的凋亡小体。说明反义组细胞出现了凋亡
DNA
的形态学改变。3 Ladder测定提取反义组、正义组、
空白组细胞,经1.5%琼脂糖凝胶电泳显示反义组细胞DNA
出现凋亡的特征性改变,即DNA呈梯度样降解并随作用时
间的延长,梯度样条带逐渐明显。而正义组与空白组细DNA
未出现凋亡的特征性改变。4细胞凋亡率 流式细胞仪检测
表明.2.5—1 2.46%,
Oumol/L反义组细胞凋亡率分别为:1
18.24%,26.65%,正义组和空白组分别为:5.45%,6.44%,
6.03%,6.98%,随着反义组细胞随浓度增加,凋亡率增加。
5)。不
反义组与正义组和空白组相比较,差异明显(PO.O
同反义组之间相比有显著差异(PO.O1)。而正义组与空白组
比较,无统计学意义(PO.05)。进一步证实了反义核苷酸诱
导子宫内膜癌细胞凋亡。5细胞周期与增殖指数变化细胞
期细胞百分率分别为:55.1O%,61.O1%,72.27%,46.OO%,
48.40%,43.77%,45.10%,S期和G2~M期细胞百分率
为:44.90%,38.99%,27.73%,54.OO%,51.60%,56.23%,
54.90%.反义组细胞
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