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人胰岛素原基因非β细胞表达质粒的构建毕业论文
①人胰岛素原基因质粒增殖。
②设计突变所需引物。
③PcR循环。
④琼脂糖凝胶电泳,回收③中的3112bp的目的基因片段。
⑤对目的基因末端平滑及5’端磷酸化处理,用连接酶连接目
的基因。
⑥连接物转化感受态大肠肝菌HBl01
⑦选阳性克隆测序。
实验结果
突变的人胰岛素原cDNA测序结果证实在人胰岛素原基因B
—C和C—A连接处引入新的裂解位点:
位点I Thr
B—C连接处:LysThr地峥ArgLy=趣、
Gin Gln
位点11C—A连接处:kuLvs血g-一Arg
Ly=Arg、l
/
结 论
理论上由单一蛋白质缺乏所致疾病是基因治疗的适应症。在
动物研究方面,许多代谢性疾病可由基因治疗而治愈。1型糖尿
病是由于胰岛13细胞自身免疫损伤而导致胰岛素分泌不足而致,
既然糖尿病是单一蛋白质缺乏,理所当然是基因治疗的适应症。
在真核细胞内蛋白质合成和分泌有两种途径:1、组成型蛋白
细胞含有特定前激素转化酶(PC:和PC,),合成成熟的胰岛素(A
链和B链复合体)。合成过程中,胰岛素原B与A链间的C肽被
裂解掉,发生在B—C连接处,裂解位置是Arg—Arg碱基;发生在
C—A连接处,裂解位置是Ly=一A唱碱基。
·2·
在过去的糖尿病基因治疗模型中,人胰岛素原基因转染非B
细胞,其主要表达为胰岛素原和少量成熟胰岛素,且不能分泌至细
胞外。在大多数非B细胞内含有特定的内源性的,依赖于高尔基
器的合成酶furin。虽然furin酶也象PC,和PC,,在二元碱基处裂
解底物,但两者底物是不同的。在非8细胞内不能合成人胰岛
素。
本实验我们的目的是通过某种方法使非13细胞能够产生成
熟胰岛素。为使非13细胞准确高效的合成成熟胰岛素,我们利用
了非B细胞内含有furin酶的特点。采用定点突变技术把fial-in酶
得人胰岛素原成为furin酶的底物,这两个新的裂解位点发生在人
胰岛素原B—C和C—A连接处。
Thr Thr
位点I LysArg
B—C连接处:LysArg峥Arg
Gin Gin
Lys
位点ⅡC—A连接处:LeuLysArg—Arg Arg
通过转染,人胰岛素原可被加工成成熟的,具有生理活性的胰
岛素。因此我们构建了一个携有突变人胰岛素原基因的质粒,通
过转染,使其在非B细胞内表达,合成成熟胰岛素,为l型糖尿病
的基因治疗打下了实验基础。
关键词:人胰岛素原基因;定点突变;htrin酶;基因治疗
·3·
CoNSTRUCTl玎强_fANPRoINS观INPLAS—曲THAT
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Postgraduate:YangUxin
Tutor: shan
YuanFeng
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