关节软骨细胞生物学行为及自体移植的实验研究.pdfVIP

上海第二医科大学2001级博士论文 关节软骨细胞生物学行为及自体移植的实验研究 中文摘要 研究目的：观察分析关节软骨细胞体外单层培养时其生物学行为变化、复层 培养对其生物学行为的影响和自体软骨细胞移植(ACI)修复关节软骨缺损。建立 人负重关节软骨细胞的分离培养技术；探讨人关节软骨细胞在单层培养过程中其 生物学行为(细胞增殖、表型和凋亡)的变化；观察复层高密度培养(以下称复 层培养)对单层传代培养的第四代软骨细胞的生物学行为的影响；评价传统的和 复层培养的自体软骨细胞移植修复软骨缺损的效果，为临床开展自体软骨细胞移 植、提高其治疗效果提供实验依据。 方法：1．10例因假体置换、肿瘤手术时截下的负重关节软骨块机械剪碎后， 在37。C培养箱内先行O．25％胰蛋白酶消化0．5h，再经O．2％II型胶原酶分离细胞 4～14h，观察软骨细胞获得率及细胞活性；这些软骨细胞在10％DMEM中培养， 观察24小时细胞贴壁率以及细胞生长状况。 2．对8例病人的软骨细胞在10％DMEM中进行单层传代培养，观察原代、 第3、4代和第8以后的细胞形态学改变；检测第2到第9代细胞的倍增时间(DT)； 第3、4、6代细胞II型胶原免疫组织化学染色来观察细胞表型的改变以及流式细 胞分析第2、4、6、8代细胞增殖指数(PI)和细胞凋亡。 3．8头猪膝关节软骨标本经上述方法分离得到的软骨细胞传代培养第四代 后，分别进入4个组别：单层培养l周组、复层培养0周组、l周组和2周组。 1周和2周时的细胞计数，观察细胞倍增时间的变化，流式细胞分析它们的增殖 指数和细胞凋亡的改变。 层软骨缺损(共32个缺损)，右膝为空白对照级和自体骨膜移植对照组，左膝为 单层培养细胞组和复层培养细胞组，上下缺损随机进入各对照和试验组。术后 5～6个月行大体、组织学、免疫组织化学检查评价软骨缺损的修复质量。 上海第二医科大学2001级博二卜论文 (2)经上述方法获得的细胞在10％DMEM中进行单层传代培养，细胞可传6一12 f4．13士1．34)天。 2．随着传代次数的增加，(1)细胞形态由原代的多角形转变为第3、4代的 短梭形，第8、9代的成纤维细胞形态；(2)DT在逐渐延长，第2代与第5到第 9代，第3、4代与第7、8、9代，第5、6代与第8、9代，均有显著性差异，P 0．05；细胞增殖指数(PI)随着传代次数的增加而逐渐减小，第2代与第6、8代、 第4代与第8代差异均有显著性，P0．05；(3)细胞1I型胶原染色逐渐变浅， 第4代细胞显色比第3代减少，而到第6代，不仅细胞形态更加铺展，细胞显色 亦明显减少；(4)第2、4、6、8代细胞凋亡指数未见明显的改变(P0．05)。 3．体外单层培养传4代的软骨细胞经复层培养后1周后，细胞形态仍保持 多角形或圆形，细胞蜷缩；与单层培养组DT(3．30士0．80)天相比，DT延长，培养 细胞凋亡明显。 4．细胞移植术后5-6个月，空白对照组缺损仅被少量的纤维组织覆盖，周 边正常软骨发生退变；单纯骨膜移植对照组修复组织变化较大，组织学仍主要为 纤维组织，且与周边组织整合不良，紧邻软骨下骨部位有少量的软骨形成；单层 培养组缺损被塑形良好的修复组织覆盖，组织学、基质特殊染色示修复组织的中、 深层为纤维软骨和透明软骨，与周边组织和软骨下骨整合良好；与单层培养组相 比，复层培养组修复组织的细胞形态、基质染色更接近正常软骨，组织的塑性更 16．29士2．63、20．43士1．8l，各组之间差异明显伊0．0t)。 型胶原酶消化4-14h分离细胞(超过6h时中途提取细胞1次)，有较高的细胞获 得率和细胞存活率；在10％DMEM中进行单层传代培养3卅周后可达第4代， 细胞数可达(O．6～1．0)x108个，可满足临床上修复15～25cm2软骨缺损的需要。 2．体外单层培养的人负重关节软骨细胞随着传代次数的增加，细胞形态由 J一海第二医科大学2001级博士论文 多角形转变短梭形，继而成纤维细胞形态；细胞分泌的II型胶原逐渐减少；细胞 的增殖能力逐渐下降，细胞凋亡未见明显的改变。第3、4代细胞能较好地保持 软骨细胞的生物学行为，可作为软骨组织工程的种子细胞来源。 3．经传代培养后的关节软骨细胞体外改为复层高密度培养后，细胞增殖迅 速下降，但短期内仍保留较弱的增殖活力；