组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞论文.docVIP

　　组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞论文 .freelosis;thrombo-embolism Abstract:AIM To develop a neotic sites from thrombo-embolism and to study the effect of gene therapy inogen activator（t-PA）gene on the formation of thrombo-embolism of vas-cular anastomotic sites.METHODS 1:Rebinant plas-mid pAdCMVt-PA ly divided into control and treatment groups.11-0nylone medical suture rat carotid artery end to end anastomoses.In the treatment group，AdCMVt-PA solution otic site ed ent group，but band could not be found in the control group.The t-PA ac-tivity could be detected postoperation on the2nd，3rd，5th，7th and14th day in the treatment，but could not be detected in the control group.CONCLUSION t-PA gene can produce t-PA having biological activity at anastomotic sites，possibly preventing the formation of thrombo-embolism effectively and developing the anastomotic patency. 0 引言 近年来，随着血管吻合技术的提高及显微外科器械的完善，微小血管吻合的通畅率不断提高，但不能达到百分之百，吻合口局部血栓形成仍是通畅率低的主要原因［1］ .临床常用抗凝药物来防治，但效果不理想［2］ ，所以有必要寻找一种局部抗凝法来提高通畅率.我们采用吻合口注射含抗凝血基因的真核表达载体AdCMVt-PA溶液，以探讨局部基因疗法对吻合口血栓栓塞的预防作用. 1 材料和方法 1.1 试剂、质粒及实验对象 RT-PCR试剂盒购自华美公司;t-PA发色底物法检测试剂盒购自上海广慈医学高科技公司;质粒pAdCMVt-PA本实验室构建;pJM17 质粒和293细胞为本实验室保存;EM+100ml L-1 小牛血清、青霉素100mg L-1 和链霉素100mg L-1 ，37℃，50ml L-1 CO2 中培养. 1.2 重组腺病毒的繁殖、纯化和滴度测定［3，4］ 提取质粒pAdCMVt-PA及pJM17 DNA，将两者用磷酸钙沉淀法共转移至含有腺病毒E1区的293细胞中进行同源重组，得到腺病毒颗粒的粗提液.用此粗提液再感染293细胞，24h后收集细胞作PCR，确定阳性表达克隆.再在293细胞中扩增腺病毒，用氯化铯密度梯度离心法制备纯化的重组腺病毒，并进行透析处理.用噬斑分析法测定腺病毒滴度.分装小管，-80℃保存备用. 1.3 重组腺病毒在吻合口局部治疗实验 将大鼠以10g L-1 戊巴比妥钠（40mg kg-1 ）麻醉成功后，作颈部正中切口，解剖出双侧颈总动脉.用两个血管夹（上、下相距约1mL）阻断一侧颈总动脉后切断之，修剪外膜，以11-0尼龙线作原位端端吻合，每个吻合口缝10针.于吻合口注入AdCMVt-PA（治疗组）或AdCMV（对照组），10min后松血管夹.同法处理另一侧颈总动脉. 1.4 目的基因转录水平的测定 术后12h，治疗组和对照组各取2只大鼠，切取以吻合口为中心1cm长的血管.治疗组、对照组血管组织各放一起，采用一步法提取组织总RNA，再行RT-PCR.PCR引物:P1:5’-CG AAGCTT ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG3’HindⅢP2:5’-CG GGTACC TCA CGG TCG CAT GTT GTC ACG AAT3’BamHⅠ由上海Sangon生物工程有限公司合成. 1.5 目的基因表达产物的活性测定 分别于术后第2，3，5，7及14日随机取治疗组、对照组大鼠各2只，取出双侧吻合口，剥离结缔组织，纵行剖开.以同组术后同天数的吻合口组织为一份标本.每份标本行组织培养24h，收集上清，用发色底物法检测t-PA活