组织培养法在关节软骨保存中的应用论文.docVIP

　　组织培养法在关节软骨保存中的应用论文 宋洪强，亓建洪，玄燕华，毕研花 【摘要】 ［目的］探讨3种保存方法对关节软骨细胞活性的不同影响，寻求效果优良的软骨组织保存方法。［方法］切取成年猪骨软骨，制成约4.5 mm×5 mm大小的圆柱形骨软骨块。采用组织培养法、慢速梯度降温冷冻法、传统慢速连续降温冷冻法对软骨块进行保存处理，观察并比较保存后软骨细胞活性的变化。［结果］保存8周时，采用传统冷冻法的关节软骨细胞存活率不足50％.freelethod on the viability of cheodroeytes so as to find out the idem method for preservation of articular cartilage.［Method］Under the aseptic condition,acquiring 240 pieces of osteoehondral plugs from both condyles of femur and tibial plateau.The control group ent using any preserved means.The tissuecultured group edium longterm preserved osteochondral plugs under the conditions of 37 ℃.At preserve 8 ination observation ohondrocytes Viability activeness change separately.［Result］The control group chnadrocyte survival rate ethod can long term preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rate of the preservation of vital articular cartilage in vitro.The chondrocyte survival rate of the tissuecultured method obvious higher than constantcooling cryopreservation method. Key a公司；程序降温仪器：国产RBLPAⅠ型程序冷冻仪；冷冻保存仪器：SANYO-80 ℃深低温冰箱。 1.2 实验动物 取清洁级健康成年长枫白猪10只20膝，无菌条件下在髌股关节及胫股关节切取正常骨软骨，制成直径约4.5 mm、长约5 mm的圆柱形骨软骨块240枚。将骨软骨块随机分为4组，每组60枚。备用。 1.3 实验方法 将骨软骨块随机分为4组，每组60枚。分别为： 对照组：即新鲜软骨标本不采取任何处理措施，取材半小时内即行组织化学、免疫组织化学观察和软骨细胞培养MTT比色法测定存活率。 实验组包括： 组织培养组（A组）：将取材的骨软骨块按体积比1∶15放入配制的普通无菌F12DMEM混合培养液（含有100 U／ml的青链霉素，pH值7.2～7.4）中，放入37 ℃ CO2培养箱保存，隔日换液1次。 慢速梯度降温冷冻组（B组）：将骨软骨块浸泡于4 ℃无菌含有15％DMSO的玻璃化保护液中浸泡2 h，然后3层无菌血浆袋包装后进行降温。先以-1 ℃／min的速率从室温降温至-4 ℃，维持30 min，然后以-1 ℃／min的速度降温至-10 ℃并维持30 min，进而以-1 ℃／min的速度降温至-20 ℃，维持30 min，再连续降温至-40 ℃，维持30 min，最后放入-80 ℃深低温冰箱中保存。 慢速连续降温冷冻组（C组）：采取文献〔1〕报道的传统方法，将骨软骨块先在4 ℃无菌10％ DMSO中浸泡1 h，然后3层无菌血浆袋包装后进行降温。首先以-1 ℃／min的速率连续降温至-40 ℃，再投入-80 ℃深低温冰箱保存。 保存后处理：实验组于保存8周时分别取软骨块进行指标检测，冷冻2组软骨块自冰箱取出后，立即行37 ℃水浴复温（复温速率约100 ℃／min）10 s，将标本从包装袋取出依次投入10％、5％的蔗糖溶液（37 ℃）中各停留5 min（洗除融解的冻存液，防止冷冻保护剂对软骨细胞产生毒性），最后移至PBS液冲洗3遍。组织液培养组从培养液中取出标本，立即在无菌PBS缓冲液中漂洗3遍，清洗掉残存的培养液。 1.4 实验指标检测： 1.4.1 软骨细胞代谢活性检测 取20枚标本4％多聚甲醛固定36 h，冲洗，10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸