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高效液相色谱法（Waters2695-2998/2424 HPLC)测定乳酸凝结芽孢杆菌 一 样品准备： 1、用250ml三角瓶装50ml的培养基，接种BCD菌株，接种量为3%，摇床发酵200r/min，温度37℃，发酵时间18h,离心5000r/min,10min,取上清液。 去除上清液中的碳酸钙：取4 ml 发酵液于5 ml 离心管中，经8000 r/min 离心10 min 以除去碳酸钙和菌体，取离心后的上清液2 ml，再加入2 ml 0.5 mol/L 的硫酸水溶液进行酸解，离心除去硫酸钙，取1 ml 上清液经适当稀释后，再以0.45 μm 的滤膜过滤即得待测液。 二 标准品准备： 乳酸、乙酸、丙酸和丁酸 草酸 、酒石酸 、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、NH4H2PO4、磷 酸 甲酸, 苹果酸, 乳酸, 乙酸,柠檬酸, 琥珀酸和丙酸 甲酸, 苹果酸, 乳酸, 乙酸,柠檬酸, 琥珀酸和丙酸(色谱纯） 草酸、 酒石酸、 苹果酸、 抗坏血酸、 乳酸、 冰乙酸、 柠檬酸、 丁二酸（均为分析纯）。 三 仪器准备： 准备流动相，和水，乙腈，甲醇 首先打开计算机，运行Empower 软件，选择存放数据文件的Project,运行Run Samples ;按软件中的Develop Methods 按钮，建立仪器方法，并保存至方法组，按Monitor 按钮，观察基线平衡，可准备进样。 开机（仪器） 2.1打开Alliance 2695和2489的电源开关至ON（1）的位置，仪器开始进行自检。 2.2仪器将进行大约5min 的自检过程，待仪器自我测试完毕后，出现一下画面，画面上方的状态显示会出现“idle”状态，表示开机测试正常。 2.3 灌注柱塞密封清洗泵 2.3.1回到Menu 画面，选择Diag 2.3.2 确定Seal Wash 的管路放在正确的位置 2.3.3 按Prime Seal Wash ,再按START ，直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管，(大概听哒哒的声音30s），按Halt ，在重复一次上述操作 2.3.4 按CLOSE 灌注针头清洗泵 3.1按Menu/Status键，进入STAUS(1)画面，利用方向键将光标移至“Composition”字段，将欲WET PRIME 的溶剂输入100%。 3.2 按 DIRECT FUNCTION 功能键， 选择 wet prime ,按 enter Wet prime 的设定值，一般为flow rate：7.5ml/min ,Time:3.0 min,然后按下OK键，泵即开始进行WET PRIME 操作 3.3 重复上述的步骤直到对所有溶剂的WET PRIME 执行完毕。 注意先乙腈后水 冲洗进样器 4.1 按Menu/Staus 键，进入Staus (1)画面，在设定溶剂的画面中设定适当的流速与溶剂比例（针对缓冲盐或离子对试验，建议设定50%乙腈；50%水的溶剂来冲洗进样器） 4.2 按Direct Function 键，选择Purge Injector ,按Eenter 4.3 输入Sample loop 体积清洗的倍数（原定值为6倍），按Enter 4.4 压缩测试（Compression Check )请先不需要测试，设定完后按OK 装载样品盘数 代号 颜色 编号 A 蓝色 1-24 B 黄色 25-48 C 红色 49-72 D 绿色 73-96 E 白色 97-120 四 样品条件设置 方法一：文献：产L_乳酸菌种的选育和发酵条件的研究_高江婧 乳酸总量测定 有机酸：乳酸 采用高压液相色谱法测定，色谱柱为美国Merck公司的ZORBAX SB-Aq，150 ×4.6(5 μm)，流速0.5 ml/min，紫外检测波长210 nm，进样量10 μl，流动相为水(含0.02 mol/LKH2PO4):乙腈= 99.5:0.5，柱温为30℃。 乳酸标样在ZORBAX SB-Aq柱上经高效液相色谱(HPLC)进行分析，自动进样，乳酸的保留时间为4.8 min。其色谱图如图2.1所示。 方法二：（蜡样芽孢杆菌） 文献：一株具有产酸能力的芽孢杆菌的筛选及性能检测 菌株代谢产物（有机酸）分析： 　采用发酵培养基，２５０ｍＬ三角瓶装液量１００ｍＬ，接种ＧＦ１菌株，３７℃，２２０ｒｐｍ培养。取ｐＨ迅速下降期，即：６、８、１０和１２ｈ发酵液５０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，所得上清液送山东农业大学化学院进行液相色谱分析发酵液中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量。液相色谱条件：高效液相色谱仪（美国Ｗａｔｅｒｓ５１０型），检测器（美国Ｗａｔｅｒｓ２４８７双波长紫外检测器），