药疹病人EB病毒和人疱疹病毒6型感染检测论文.docVIP

　　药疹病人EB病毒和人疱疹病毒6型感染检测论文 杨婷婷 朱桂芝 陈官芝 罗兵 【摘要】 目的 探讨EB病毒（EBV）和人疱疹病毒6型（HHV6）感染在药疹发生中的作用。方法 采用PCRSouthern blotting检测药疹病人和正常对照组外周血单个核细胞中EBV DNA；采用巢式聚合酶链反应检测HHV6 DNA，并对HHV6阳性标本进行酶切分型；采用ELISA法检测EBV VCAIgM；采用RTPCRSouthern blotting检测EBV即刻早期基因 BZLF1 mRNA。结果 药疹病人EBV DNA阳性率(77.42%，24/31)明显高于正常对照组（χ2=77.84，P 0.01），但HHV6阳性率（32.26%，10/31）与正常对照组比较差异无显著性（χ2=3.00，P 0.05）。10例HHV6阳性药疹病人全部为HHV6A 亚型，未检测到HHV6B亚型；而正常对照组73例HHV6阳性标本中有13例为HHV6A亚型。药疹病人EBV VCAIgM阳性率（19.34%.freelRNA阳性病人中有4例检出HHV6 DNA，药疹病人BZLF1 mRNA检出率与HHV6有明显的相关性（r=0.45，P 0.05）。结论 药疹病人存在EBV的活动性感染，且EBV和HHV6可能有相互激活作用。 【关键词】 药疹；疱疹病毒4型,人；疱疹病毒6型,人 ［ABSTRACT］ Objective To study the role of EpsteinBarr virus (EBV) and Human Herpesvirus 6 infection in drugeruption patients. Methods EBV DNA al control by PCRSouthern blotting, and HHV6 DNA by nestedpolymerase chain reation, the positive samples RNA ples. Results The positive rate of EBV DNA (24/31,77.42%) in the patients al control (χ2=77.84,P 0.01),but the difference of HHV6 al control, HHV6A subtype al control (χ2=4.61,.freelRNA positive, four RNA atically correlated ay exist EBV and HHV6. ［KEY gCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1.0 U，DNA 模板4 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩增35个循环；最后72 ℃延伸5 min。以外侧引物的PCR产物为模板进行内侧PCR扩增反应，内侧PCR反应体积25 μL，反应体系包括10×Buffer 3 μL，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，4×dNTP为0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，内侧引物浓度0.5 μmol/L，外侧PCR产物2 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃变性 30 s，56℃复性30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取8 μL内侧PCR产物于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察电泳结果，外侧PCR扩增产物长为287 bp，内侧PCR扩增产物长为163 bp，同时以HHV6 GS株为阳性对照，阴性对照为HHV6阴性JJhan细胞系。 1.2.4 HHV6的PCR产物酶切分型 取HHV6内侧PCR阳性扩增产物（163 bp）用限制性内切酶HindⅢ进行酶切分析。反应体积为20 μL，反应体系包括10×Buffer 2 μL，PCR产物10 μL，HindⅢ10 U，去离子水补充体积至20 μL，置37 ℃水浴消化12～16 h。取酶切产物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳（80 V，90 min），凝胶用溴化乙锭（0.5 mg/L）染色20 min，凝胶成像系统观察电泳结果。 1.2.5 EBV VCAIgM抗体检测 采集受检者外周血的分离血清，采用ELISA法检测EBV衣壳抗原（VCA）特异性IgM 抗体，诊断试剂盒购自德国NOVATEC公司。具体方法参照试剂盒说明进行，对阳性标本进行重复实验。 1.2.6 PCRSouthern检测EBV DNA PCR反应总体积为25 μL，反应体系为：10×Buf