测序技术介绍.ppt

SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * SOLiD测序 * 三者比较 Ｒｏｃｈｅ／４５４测序技术读取长度（６００～１　０００ｂｐ），在３种测序技术中最长，可以对未知基因组进行从头测序，但其通量最低（０．５～１Ｇｂ／ｒｕｎ）。当遇到ｐｏｌｙｍｅｒ（如ＡＡＡＡＡＡ 等）时，碱基个数和荧光信号强度不成线性关系，即判断重复碱基有困难。 * 三者比较 Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ属于高度自动化的系统，读取片段比其它种类的测序多，适合进行大量小片段的测序（如ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ），其测序通量大，其新机型Ｈｉｓｅｑ　２０００产出量为６００Ｇｂ／ｒｕｎ，但基于可逆反应时随反应轮数增加效率降低、信号减弱，并且读长（通常为１００ｂｐ）比Ｒｏｃｈｅ／４５４短，给从头测序拼接带来困难。 * 三者比较 ＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ技术每个碱基读取２次，有非常高的准确性，特别是针对ＳＮＰ的检测。此外，灵活的系统和完善的磁珠编码系统可以进行样品的ｐｏｏｌｉｎｇ来分割测序区域，特别适用于具有高质量参考基因组序列物种的重测序，但是该测序读长（５０ｂｐ）最短，并且读取长度受反应轮数的限制，给从头测序拼接带来困难。 * 第三代测序技术 原理： 脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。 * 第三代测序技术 技术关键： 第一：因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止。 第二：共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。 * 第三代测序技术 技术特点： 1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。 5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。 * 第三代测序技术 * * * 各自的优点 454 测序平台得到的片段能够达到400 bp，并且读长的质量高； Solexa 测序平台的性价比最高，在数据量相同的情况下，测序成本仅为454 测序平台的1/10； SOLiD 测序平台准确度能够达到99.94%，在片段覆盖率为15×时，测序准确度可接近100%。 2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta g