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慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染 包装 包装细胞 Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P11）; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16) Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P1）; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P1)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）； 细胞转染 方法一： Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P1）; Lenti-X? shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)； 方法二： 按照Lipofectamine? LTX Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下： a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%； b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基； c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟； d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix Lipofectamine LTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀； e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟； Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX) 15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1) 455 μl Opti-MEM 15 μl PLUS Reagent 45 μl Mix Lipofectamine LTX Up to 500μl Opti-MEM 500 μl Total Volume 500 μl Total Volume f. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。 g. 将细胞放入置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养，12小时后换上新鲜的培养基继续培养。 h. 转染后48-72h，收取培养上清，500g离心10min或利用0.45 μm 低蛋白吸附滤膜去除细胞碎片和团聚的病毒； 方法三： C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf（目前唯一使用方法） 病毒上清收集 转染后12h, 48h,72h分别收集一次； 纯化 方法一： (i) 病毒上清（接一、包装 4.病毒收集）. (ii) Add 51 ml of a 50% PEG 6000 solution. (iii) Add 21.7 ml of a 4 M NaCl stock solution. (iv) Add 23.3 ml of PBS. This will result in a final volume of 300 ml. The final PEG 6000 concentration will be 8.5% and the final NaCl concentration will be B0.3 M. (v) Distribute the sample as 150-ml aliquots in two 250-ml polypropylene wide-mouthed bottles. (vi) Store the bottles at 4 1C for 1.5 h. Mix contents every 20–30 min. (vii) Centrifuge bottles at 7,000g for 10 min at 4 1C using a Beckman fixed-angel JLA-10.500 rotor. (viii) After centrifugation, a white pellet should be visible. (ix) Carefully decant the supernatant and ad