细胞产物分析技术-吸光光度法-2012.ppt

吸光光度法 基本原理 仪器简介 灵敏度与准确度 分析条件的选择 应用简介 基本原理 基本原理 基本原理 吸收光谱 Absorption Spectrum 基本原理 基本原理 吸收定律与吸收光谱的关系 吸光的加合性 吸光分析法 光电比色法 单波长单光束分光光度计 单波长双光束分光光度计 测定波长的选择 参比液的选择 分析条件的选择 分析条件的选择 酸度的选择 显色剂的用量 应用简介 单组分的测定 示差光度法 电子伏特 * * 吸光光度法 是基于被测物质的分子 对光 具有选择吸收的特性而建立的分析方法。 光的电磁波性质 ? ?射线 x射线 紫外光 红外光 微波 无线电波 10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm 可 见 光 完全吸收 完全透过 吸收黄色光 光谱示意 表观现象示意 复合光 光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的 性质及光的性质有关。 物质对光的吸收 物质对光的吸收满足Plank 条件 h? S2 S1 S0 S3 E2 E0 E1 E3 h? h? h? 纯 电子能态 间跃迁 S2 S1 S0 S3 h? E2 E0 E1 E3 S2 S1 S0 h? A ? h? h? h? 分子内电子跃迁 带状光谱 锐线光谱 ? A 基本原理 物质对光的选择吸收物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。 例： A 物质 B 物质 同理，得： 1 ev = 1.6?10-19 J. 透光率 （透射比）Transmittance 透光率定义： T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 % 入射光 I0 透射光 It T ： 透光率 A： 吸光度 Lambert – Beer Law 基本原理 b ：吸光液层的厚度，光程， cm c：吸光物质的浓度， g / L, mol / L K：比例常数 K ? ? K ? a c：mol / L c：g / L A C 吸光定律 A或? ? 吸收光谱 A ? C ? max 基本原理 多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即 对吸收定律偏离 A C 主要原因 非单色光 吸光质点的相互作用 基本原理 目视比色法 标准系列 未知样品 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分 方法简便，灵敏度高 Ultraviolet Visual Spectroscopy 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 I0 It 参比 样品 入射光 I0 透射光 It 仪器简介 紫外-可见分光光度计组件 光源 单色器 样品池 检测器 信号输出 氢灯，氘灯，185 ~ 350 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm. 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 光栅 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 平面透射光栅， 反射光栅 玻璃，光学玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器） 表头、记录仪、屏幕、数字显示 仪器简介 0.575 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 仪器简介 比值 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 光束分裂器 仪器简介 灵敏度 吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达10-3 ~10-4 g / L 或 ~?g / mL 数量级。 准确度 能满足微量组分测定的要求。一般相对误差 2~5 %。例如，石灰石中微量铁，含量为 0.067 %，相对误差以 5 %计算，结果为 0.064 ~ 0.070 %，绝对误差为 0.003 % 灵敏度与准确度 对同一种待测物质，不同的方法具有不同的 ? ，表明具有不同的灵敏度。 例，分光光度法测铜 铜试剂法测 Cu ? 426 = 1.28 ? 104 L．mol-1．cm-1 双硫腙法测 Cu ? 495 = 1.58 ? 105 L．mol-1．cm-1 一般情况 ? 104 ? ~ 104 ~105 ? 105 低灵敏度 中等灵敏度 高灵敏度 灵敏度不同的本质原因是什么 ？ 灵敏度与准确度 根据误差传递公式，推导出浓度测量的相对偏差为 T = 0.368 = 36.8 % A = 0.434 为了减少测量误差，控制溶液的吸光度 A = 0.15 ~ 1 T = 70 ~ 10 % 误差公式推导 0.368 灵敏度与准确度 无干扰，选择 ?max 有干扰